激发-扫描高光谱成像显微镜，以有效区分荧光信号

该协议非常重要，因为它描述了一种可用于在单个样本中分离多个荧光信号的方法。与传统方法相比，激励扫描可以提高实验速度，提高数据的灵敏度。通过使用不同的照明源，如超级连续激光器，该方法可适用于旋转盘或激光扫描共匀显微镜系统。

在执行激发扫描、光谱成像显微镜时，必须检查每个荧光标签的激发峰值是否发生在不同的波长上。首先，设置一个倒置荧光显微镜和相机，如文本协议中所述。然后在舞台上加载样品。

从微管理器主窗口的下拉菜单中，选择 475 纳米进行初始样品查看。然后双击曝光旁边的框，输入 100 以将曝光时间设置为 100 毫秒。最后，单击"实时"以查看示例。

现在点击自动。自动强度查看范围按钮，可将最小值和最大值引入有意义的可视范围。接下来，使用显微镜的对焦旋钮对样品进行聚焦。

一旦对焦，调整样本的位置，使其边缘位于视场的中心。然后微调焦点。当图像中的边缘特征看起来锐利时，示例处于焦点。

现在，打开多维采集工具。在菜单中，单击加载按钮并选择包含适当波长范围的预设设置以进行光谱采集。确认采集设置后，移动到样本的空白区域，然后单击"获取"以收集包含背景和杂色的光谱图像堆栈，以用于以后的减法。

然后，在样本上移动以查找最亮的区域。样品可能具有更强烈的荧光远离样品的边缘。找到最亮区域后，请进行单个图像堆栈。

将采集的图像加载到图像 J 中，并使用图像 J 的测量功能确认没有波长包含过度曝光的像素。如果由于曝光过度而需要缩短曝光时间，则还应用新的曝光时间重新使用背景图像。如果发现任何图像包含摄像机的向上检测极限，请调整光谱扫描的曝光时间，以确保整个光谱范围内的最大信号不超过摄像机的动态范围。

现在确定适当的曝光时间后，将未标记的样品放置到舞台上。从未标记的样本获取光谱图像数据，以确定是否有任何潜在的自动荧光。然后，在舞台上放置一个单标记的样本。

从每个单标记样本获取光谱图像数据，用作光谱控件以构建光谱库。使用相同的波长范围曝光时间和摄像机设置对每个控制样本执行扫描。接下来，在显微镜上放置一张包含实验样品的幻灯片。

选择具有适当标记的单元格的视场，并使用确定的采集设置从样本获取光谱图像数据。通过从样本图像中减去背景光谱并乘以校正系数来校正图像，将图像校正到平面光谱响应。在这里，MATLAB 脚本用于快速处理图像。

接下来，生成光谱库。为了获得最佳效果，通过确定哪个波长波段具有最强值并将每个波长波段的测量值除以该最大值，使每个端子段与最大强度的波长带规范化。然后将光谱数据另存为 dat 文件。

完成后，取消混合光谱图像数据。取消混合步骤将生成每个荧光标签的丰度图像，其中丰度是图像中来自预期标签的相对荧光信号量。接下来，打开每个未混合的图像以直观地检查纯组件的分布。

将错误图像的大小与未混合图像的大小进行比较。如果误差图像的幅度与未混合丰度图像相似，则频谱图像数据中的信号可能无法准确计算。最后，通过将错误图像与未混合图像进行比较，检查是否有未识别的残差结构。

如果执行正确，光谱解混过程允许将光谱图像堆栈分离到每个荧光标签中各自的贡献中。在这里，一个未混合的光谱图像集与个别图像突出显示气道平滑肌肉细胞自荧光，GCaMP探头和线粒体标签。与细胞的核区和近核区有关的误差很高，表明光谱库中的光谱未很好地解释这些区域的测量光谱。

从同样自发光的标记细胞中收集的纯光谱可能会污染纯成分的光谱轮廓。在这里，我们可以看到与受自荧光污染的纯光谱的解混与缩放减法后校正的纯光谱的区别。在成像敏感样本时，适当的数据采集至关重要，因为它们可能只能存活一次成像会话，而与可能重新成像的背景和控制不同。

确保尽可能预先确定正确的硬件和采集设置。作为下一步，使用该系统采集的延时数据创建的视频可用于跟踪一段时间内隐蔽位置的荧光源，例如第二信使信号定位。使用强大的光源时小心，以避免眼睛暴露。

此外，在处理生物标签时，请务必佩戴适当的手套。