人类舱内单聚物研究病原体、共脉和宿主肠道上皮细胞之间的相互作用

3D肠道器官培养限制了宿主上皮-病原体相互作用的研究，因为流明不能直接被细菌或毒性因素接近。此外，小分子、蛋白质或粘液等分泌物质无法轻易地从 3D 培养物中取样，以便进行下游分析。为了解决这些限制，我们提出了一个修改的协议，用于将 3D 人肠或结肠体转换为单层。

结肠单层分泌一层厚厚的、高小的粘液层，允许对病原体-粘液相互作用进行活体研究。该方法旨在为研究感染时最早的肠道宿主-病原体相互作用提供一个可操作的模型。结肠单层将允许一种新的方法来研究粘液生物学，这对于宿主-病原体相互作用，微生物群研究和炎症性肠病非常重要。

该方法可应用于其他粘液分泌器官，如上胃肠道、呼吸系统和女性生殖系统。视觉演示将帮助用户在单层生长期间和免疫污染固定期间保存粘液。展示这个程序的将是卡罗尔·多克拉德尼，一个来自我们实验室的工作人员科学家。

孵育涂层细胞培养后，从24井板中吸出培养基，每井用一毫升冰冷收获溶液代替。使用微型细胞刮刀将地下室膜基颗粒分离并分解。特别注意井边附近的任何材料。

然后，在4摄氏度下以每分钟约200转的速度在轨道摇床上搅拌板，30至45分钟。使用装有无菌滤液尖的 P200 单通道移液器对细胞悬浮液进行三化。在15毫升圆锥体中送电池悬浮液。

如果总悬浮量大于六毫升，请使用多个小瓶。之后，在小瓶中加入一个等量的高级DMEM/F12介质，其中含有10毫摩尔海苯、L-alanyl-L-谷氨酰胺二肽和青霉素链霉素。这是洗涤介质。

反转小瓶三到四次混合。在4摄氏度下以300倍g离心10分钟。在细胞电镀之前，将涂层刀片在组织培养培养箱中平衡至少 30 分钟。

对于每个要镀的刀片，在37摄氏度的水浴中加热一毫升的膨胀介质，并添加两个抑制剂。然后，将混合物加入井中。从含有细胞颗粒的管子中吸出洗涤介质，用足够量的膨胀介质代替，每次插入并重新暂停至少产生 100 微升。

然后，从每个刀片中吸出胶原蛋白 IV 溶液，然后用每插入的 150 微升洗涤介质洗涤两次。移液器600微升的膨胀介质进入每个刀片下方的空间。移液 100 微升细胞悬浮液从小瓶进入每个刀片。

将板返回组织培养箱，离开不受干扰至少12小时。避免摇晃或急剧倾斜板。孵育后，将板放在相对比光显微镜上，用2.5倍至10倍的客观透镜。

使用培养基刷新，无抑制剂，停止抑制治疗。每两到三天继续刷新介质，直到汇合。用细尖钳或钳子从 24 井板中提起细胞培养插入。

小心地倒置在实验室纸巾上，取出粘附在刀片的外部液体中。在一个新的24井板中，将刀片浸入一至三个冰酸溶液和绝对乙醇中，在室温下浸泡10分钟。然后，在长凳上，将插入物倒置到纸巾上，取出固定剂。

将刀片放在装满 1X PBS 的塑料容器中 10 分钟，以补充细胞水分，然后再继续执行标准的免疫处理协议。要保存，请使用剃刀刀片切割刀片周围的插入膜。使用钳子，将膜转移到玻璃显微镜幻灯片上。

然后，添加安装介质并粘贴盖玻璃。在这个实验中，人类肠和结肠培养物作为3D结构生长，然后分离和分段，用于在人类胶原蛋白-IV涂层细胞培养物的电镀上。通过光领域的显微镜和免疫荧光染色，每天监测单层形成的进展。

在人类胶原-IV涂层过滤器上播种的殖民地碎片在播种后两到四天形成多个单层岛屿。具有相应正交投影的最大强度投影和共合光学 Z 节均表明，由于不存在核和假 F-actin 染色，可以识别无细胞区域。在播种后大约一周，通过F-actin免疫污化检测到具有连续蛋白表面的汇合结肠单层。

具有代表性的最大强度投影和共声光学部分与相应的正交投影的高放大倍率显示，汇合结肠单层中的细胞形成 F-actin 近交环和未成熟的同源刷边框。EdU 的合并表明，在 Jejunal 单层分化期间，扩散逐渐丧失。与五天的分化后，未分化的杰琼单层具有更宽、更短的细胞，并且与杰琼单层相比，较不成熟的基于阿皮基的毛笔刷边框。

分割结肠体至关重要。如果碎片太大，它们不会附着在涂层滤光片上，而是会转换为 3D 结肠。我们提出了一种改进的方法，研究结肠单层粘液生物学。

可以进行其他宿主-病原体研究，以研究病原体与肠道病原体表面之间的相互作用。