从牙髓中获取干细胞的标准方法效率很低，这取决于几个变量。我们的协议允许在90%的病例中成功地从经过治疗的牙齿中分离干细胞。在几周内获得大量细胞是主要优势。
这使我们能够在再生医学中使用细胞，并创建一个生物库，为其他科学家提供这个有用的工具。打开牙齿的过程将由康斯坦丁诺·桑塔克罗斯医生执行。随后，我实验室的博士生斯特凡诺·马泰卢奇将展示该协议，他是本文的第一作者。
首先，从患者身上提取第三个摩尔，用PBS快速冲洗，用介质放入15毫升的试管中，并在两小时内将其转移到实验室。在生物危险罩下，使用切割机通过冠冕切割通道（平行且切线）穿过纸浆室的屋顶打开牙齿。使用小型挖掘机，轻轻取出纸浆，并将其放在试管中。
然后，用PBS洗涤三次，在室温下以2，500次g离心10分钟。离心后，取出上经剂。将颗粒重新在汉克溶液中，然后将样品转移到培养皿中。
在室温下以 2，500 次 g 离心去除汉克溶液 10 分钟。然后，用一次性手术刀，将纸浆分成大约一毫米的切片，并加入一毫升的IV型胶原酶。接下来，在室温下以2，500倍g将样品离心10分钟。
取出上一液，并在介质中重新暂停颗粒。在37摄氏度（5%二氧化碳）下，在T25烧瓶中培养它，用于干细胞。在孵化期间，每三天更换一次培养媒介。
一旦粘附细胞达到汇合，加入一毫升的 trypsin-EDTA 溶液到细胞分离，并在37摄氏度下孵育细胞3分钟。接下来，以一比五的比例加入培养介质的四毫升，以停止尝试性作用，并将细胞悬浮液以259倍g离心6分钟。拆下上一液。
然后，将细胞放在 T25 烧瓶中进行繁殖。然后，在37摄氏度下用一毫升的三辛-EDTA分离细胞，三分钟。将电池悬浮液以259倍g离心6分钟。
取出上流剂，然后继续测试细胞进行细胞荧光分析。为了执行瞬态普里昂蛋白沉默步骤，首先用培养培养基培养基的两毫升将人类牙髓干细胞培养在六孔板中，24小时。然后，将400微升的小干扰RNA PrP介质添加到每个样品中，并在37摄氏度下孵育6小时。
在不丢弃siRNA PrP介质的情况下，以1比5的比例加入1.6毫升培养的培养介质，并将细胞留在37摄氏度下72小时。孵育期后，取出上经剂，在室温下用两毫升PBS清洗细胞三次。然后，加入两毫升的神经元培养培养培养，并在37摄氏度的培养箱中保持细胞7至14天。
孵育期后，在室温下用两毫升PBS清洗细胞三次，进行西印分析，以测试神经元表面抗原。为了执行神经元诱导过程，在六孔板培养200万个人类牙髓干细胞，从纸浆分离到28天。每三天，丢弃上一个。
在室温下用两毫升PBS洗涤三次，并更换两毫升的神经元培养培养。7至14天后，在37摄氏度下用1毫升的三辛-EDTA分离细胞3分钟。然后，以一比五的比例加入培养介质的四毫升，以停止尝试性作用。
为了通过流式细胞学来描述人类牙髓干细胞，在六孔板中培养200万个细胞，并培养两毫升培养基。在牙科纸浆分离后28天或再用神经元培养媒介再14天后，在37摄氏度下加入一毫升的尝试性EDTA，三分钟分离细胞。接下来，以一比五的比例加入培养介质的四毫升，以停止尝试性作用，并在室温下以259倍g离心6分钟。
在4摄氏度的高温下，用300微升4%的半成醛将未经处理或经过处理的细胞修复10分钟。接下来，离心机，丢弃上一代，并在室温下用PBS中1%的非离子表面活性剂渗透细胞，再增加10分钟。然后，再次离心，丢弃上一代，并在室温下用5%脱脂干牛奶在PBS的一毫升中进行一小时的阻杀。
用一毫升PBS洗涤三次，在室温下用抗CD105、抗CD44、抗TROD-1、抗CD90、抗CD73、抗β-三管蛋白、抗NFH和抗GAP43单克隆抗体孵育细胞一小时。接下来，每隔六分钟用一毫升PBS连续三次离心细胞，然后在室温下用抗小鼠PE或抗兔CY5单克隆抗体孵育一小时。使用二级抗体对免疫阳性细胞进行检测，并使用流动细胞计分析所有样本。
培养200万细胞每毫升的人类牙髓干细胞在六孔板与两毫升的培养媒介。在牙科纸浆分离后21天和28天，或再用神经元培养媒介再分7至14天后，在37摄氏度下加入一毫升的三角素EDTA，三分钟分离细胞。然后，离心机，丢弃上经剂，然后在4摄氏度的PBS中用4%的甲醛固定试样10分钟。
接下来，离心，丢弃上一代，然后在室温下用1%非离子表面活性剂在PBS中渗透10分钟。去除上流剂，并在室温下用兔子抗PP单克隆抗体染色细胞一小时。最后，离心，丢弃上经剂，然后在室温下用抗兔CY5单克隆抗体再孵育一小时。
使用流动环测仪分析所有样品。纸浆分离后，人类牙髓干细胞的簇在外围扩展。EGF/bFGF诱导的神经元分化之前和之后这些细胞的生长比较表明，细胞形态和中性生长有显著变化。
未经处理的人类牙髓干细胞表达多能中质质特异性表面抗原，如CD44、CD90、CD105、CD73和TRO-1。在适当的神经元诱导刺激后，这些细胞表示特定的神经元标记，如β-三管，NFH和GAP43。未经治疗或经过治疗的细胞没有表达造血标记，如CD14和CD19。
28天后，与相应的负对比相比，在人类牙髓干细胞中早熟地表达普里昂蛋白，在EGF/bFGF诱导的神经元分化过程后，其表达增加。西方印迹分析表明，在EGF/bFGF刺激作用之前，通过sRNA沉默prion蛋白，可以通过阻止神经元标记β-三-tubulin和NHF的表达，影响人类牙髓干细胞的神经元分化过程。最重要的是选择酶将细胞从纸浆中分离出来。
事实上，如果酶太具有攻击性，细胞可能会受损，其生长和分化能力可能受到损害。牙髓干细胞是一种极好的实验模型，可以在体内和体外研究中用于再生医学领域。由于PrP在牙髓干细胞的神经元分化过程中起着关键作用，因此该标记可能是神经退行性疾病的有效靶点。
最重要的方面是病人的健康状况，例如没有传染病。
