木本植物的赛莱默水分布,用低温扫描电子显微镜可视化

该协议的总体目标是为我们在各种木球细胞中就地的配水提供电微镜分辨率。这种方法用于观察木耶勒的水，以澄清水的分布和不断变化的水系、水分布的季节性变化、冻结/解冻循环的影响、湿木中水的分布以及某些生物应力引起的气穴。在高液压张力下冻结固定活树干有时会导致人工气穴，低温-SEM 将这种气穴观测到导管流明中的破裂冰晶。

此更新程序侧重于获取高质量的西莱默的高质量航空学显微图，而无需在采样过程中使用伪影。可行的演示至关重要，因为有许多重要细节是不容易解释的。同时，获得培训并不容易，因为世界上只有少数实验室练习这种方法。

要开始此过程，请将树枝和叶子封闭，用黑色塑料袋进行取样，以平衡 xylem 和叶子之间的水位，并在取样前两个多小时进行平衡。使用压力室，确定样品中至少两片叶子的水电位。当水位高于约负0.5兆帕斯卡时，在冷冻后可以采集样品。

当水位低于负0.5兆帕斯卡时，继续治疗放松。在茎周围固定一个防水的衣领，该领子将充满水。使用修剪剪或锯，在水面下切割茎，并保持样品的切口在水下。

尽快将样品转移到另一个容器中的水中，以最大限度地减少切口暴露在空气中。对于广离开的物种，确保从获得SEM低温样品的点到收获茎的切削边缘的长度超过样品的最大容器长度，以防止低温样本内张力引起的伪影。接下来，用黑色塑料袋盖住样品，以减少蒸腾。

将样品的切入端保持在水中，并保持此状态约 30 分钟，以缓解木球张力。在此之后，再次测量水的潜力，以确认木勒张力的放松。首先，使用剪刀或实用刀切割并打开水密衣领的一侧。

用胶带将衣领紧紧贴在阀杆上，同时水平握住孔径。戴上绝缘手套，安全握住液氮容器。将液氮运行到衣领中，直到其充满，并持续加注额外的液氮，以完全冻结 xylem 中的水。

足够冷冻后，将衣领从样品杆的冷冻部分分离，以去除液氮。立即使用细手锯来采集样品。然后用一块铝箔盖住冷冻样品，或放回样品管中。

快速将收获的样品放入装满液氮的容器中。将样品存放在零下 80 摄氏度，直到准备好执行观察。首先，将低温恒温器的试样室温度设置为零下 30 摄氏度，通常足够冷，使大多数植物的木草汁处于冻结状态。

使用锋利的刀或细齿锯将样品修剪成一小块，可根据低温 SEM 的试样支架进行调整。将修剪过的片子安装到夹头上，这是低温恒温器的支架，用组织冷冻嵌入介质进行低温分段。将夹头连接到低温恒温器微原子的试样支架上。

通过反复剃掉五到七微米厚的部分来修剪表面。将总深度从1000微米到2000微米外切到初始表面，对于对预切割造成的样品的损坏部分进行去敏化是有用的。大致修剪样品表面后，调整样品表面上方微切刀片未使用的部分。

稍微扩大试样表面和刀片之间的距离。并且只切割一次或两次表面。然后，再次滑动刀片，将刀片的未使用部分放置到试样表面上。

重复此切割加工三到四次，以获得无刀痕的透明表面。最后切割后，将刀片的位置设置在远离样品的位置，以防止灰尘粘附在样品上。将夹头从微原子中分离出来。

接下来，将试样连接到低温热室中具有组织冷冻嵌入介质的低温 SEM 试样支架上。首先，根据设备用户手册，使用液氮在低温-SEM试样室中保持零下120摄氏度的温度。接下来，将装有准备好的试样体的试样支架放入低温热室中装满液氮的绝缘容器中。

使用试样交换杆将试样支架放在液氮下方。在开始疏散前室后，快速将试样支架转移到低温-SEM 样品室的预送室。首先，打开电枪的加速度电压。

接下来，将试样阶段的温度升高到零下100摄氏度。等待几分钟，以去除霜尘，让木兰细胞中的冰的表面水平与细胞壁相比略有减少。然后，将斯派里姆阶段的温度降至零下120摄氏度。

在这项研究中，低温-SEM观察方法用于清晰地显示细胞尺度上的水分布。在低放大倍率下，图像中的黑色区域表示水完全或部分消失的空腔，而灰色区域表示木球细胞壁、细胞质和水。在高放大倍率下，水显然不会完全从三个气管的亮度中消失，这表示在原位木液中出现宏气泡。

对于广离开物种，在血管内很容易发现气穴的发生，而水的存在很难区分在纤维内部，特别是在低放大率下。细胞质和白细胞可以通过冰面纹理与气管内或容器中的水区分开来。对温度对冻蚀过程的影响分析表明，冻尘逐渐升华，内皮坑膜随着温度的升高而升华，效果越来越清晰。

剩余的大型霜冻粉尘颗粒可以通过进一步冷冻蚀刻来消除。但是，这可能是有问题的，因为它不必要地降低了木莱管道中的冰的表面水平。高质量的观测主要通过精确的标本制备实现。

用微原子的锋利刀片使表面平滑尤为重要。使用刀片的平滑不足有时会形成类似于刀痕的粗糙表面，或者可能会从切割中产生大量灰尘。样品冻结而不松弛负水柱压力会导致木莱管中气穴的神化诱导。

在样品容器中观察到聚集的冰晶，这些容器的样品没有放松。相比之下，在具有类似水潜力的放松样品样本中，没有观察到聚类冰晶。将冷冻固定应用到遭受干旱的活植物中，可能会诱发以结果为基础的神器，如聚类冰晶。

这些神器导致对木兰管道中水状态的误解。因此，在冷冻固定之前，首先确认样品的水潜力是十分重要的。虽然这个程序提供了一个图像，在木线管道什么状态，活树必须被摧毁的观察。

将其他非侵入性观测方法（如 MRI 或 micro-CT）与辅助级图像观察相结合，将加深我们对水运和使用性质的理解。本文介绍的水状态观测也将为澄清细胞中水与其他解剖反应对非生物或生物应激的关系提供一种方法。配备能量分散X射线光谱或顶部SIM的冷冻SEM用于研究含有水的标本表面的元素分布。

结合元素分析和这个类似的框架的过程可以给我们关于与水状态相关的木球细胞行为的深刻认识。使用液氮冷冻固定房间样品时，不要忘记通风房间，避免缺氧。