平滑肌细胞近系追踪小鼠晚期动脉粥样硬化病变细胞成分的定量分析

我们的协议帮助研究人员实施标准化的实验管道，通过免疫荧光染色对类似人群进行表型表征。通过这项技术，研究人员可以严格分析复杂疾病组织的类似组成，对感兴趣的细胞类型的表型进行定性和定量分析。演示这个程序的将是西德尼·马汉，一个来自我实验室的技术人员。

为使动物为胸腺动脉的收获做好准备，将腹膜切到胸骨，注意不要损害腹部组织。并在中轴线通过胸部进行两次切口，注意不要损害心脏和肺部。然后，切开隔膜，部分暴露心脏。

要大量使用小鼠，请安装重力灌注系统，使富液的压力相当于平均尿毒血，以便保持血管形态的一致流动和维护。然后，用5毫升的室温PBS，10毫升的4%室温半成甲醛，以及5毫升的室温PBS。将 23 或 25 量蝶针连接到重力灌注系统，然后通过针头运行 PBS 以将空气从管子中排出，然后再将针头插入左心室。

将针头固定到位后，使用虹膜剪刀在右中庭中做不到两厘米的切口。将感兴趣的组织收获成新鲜4%的甲状甲醛。要暴露胸腔动脉，请使用剪刀将胸骨的中线切口通过胸腔，并使用钳子拉肋骨的两侧以完全打开胸腔。

接下来，将动物置于解剖显微镜下，以部分可视化胡萝卜素，并使用细钳子拉肌肉、结缔组织和脂肪，直到右侧胡萝卜素、胸腔动脉、亚胸腔分叉和主动脉拱门清洁和分离周围的结缔组织和脂肪。接下来，使用钳子抓住其分叉下方的右侧卡罗蒂，并在钳子上方进行初始切割。尽管如此，还是拿着胡萝卜，通过亚冠动脉进行第二次切口，最后两次切入胸腔动脉两侧的主动脉拱门。

然后，收集任何其他感兴趣的血管组织，并在室温下将脑脑动脉和其他组织放在4%的甲醛溶液中过夜。对于脑动脉的免疫荧光染色，使用微原子通过石蜡嵌入组织样本获得10微米分段，直到光显微镜可以确认主动脉已切过，胸腔动脉可见。调整块的方向，直到组织完全垂直于微切刀片，并获得三个连续10微米厚的胸腔动脉每个玻璃幻灯片部分，直到达到亚截面分叉。

收集所有部分后，将组织样品水合在化学罩下，进行两次五分钟二甲苯浸入，然后进行五分钟浸入乙醇系列，以及两次五分钟脱水浸水。接下来，根据标准方案，在抗原检索解决方案中孵育幻灯片，随后在微波炉中加热20分钟。在室温下冷却一小时后，使用疏水笔包围每个组织部分。

并在室温下用阻塞缓冲液阻止任何非特异性结合一小时。在孵化结束时，在四摄氏度下将组织样本与感兴趣的原抗体鸡尾酒或等型匹配IgG控制抗体标记过夜。第二天早上，在PBS中洗三次，每次洗涤5分钟，随后在适当的荧光结合二次抗体鸡尾酒和DAPI中孵育一小时，用于细胞核可视化。

然后，使用适合荧光显微镜的安装介质将盖玻片安装到幻灯片上。对于标记组织部分的共声显微镜成像，请使用沾有 IgG 控制和初级抗体的部分来设置探测器的灵敏度、激光功率和每个通道的偏移量。然后，设置 z 堆栈采集的上部和下部位置，并确定要成像的堆栈的厚度和数量。

获取所有图像后，打开 ImageJ 中的图像并打开通道工具面板，并伪颜色不同的染色通道。合并颜色通道。所有通道应在同一图像上可见。

在通道工具面板中打开和关闭各个颜色通道，右键单击计数图标以选择多点工具。双击计数图标以打开点工具面板，然后选择用于计算单元格的项目的类型和大小。检查全部显示并仅在通道工具面板中打开 DAPI 通道。

然后，选择计数器通道零并单击要标记的单个核，滚动通过 z 堆栈来计算感兴趣区域内染色的所有核。点工具面板中显示的量化单单元格事件数如下。当所有核都标记后，打开另一个染色通道并选择计数器通道一个，以标记 DAPI 和抗体染色之间有结肠化的细胞。

对于细胞质染色，选择细胞核周围的整个细胞核，并检查多个z堆栈，必要时。然后，结果可以表示为单元格数到 DAPI 阳性细胞的总数，或感兴趣区域内每个区域的单元格数。如所证明，使用针对表型标记的抗体进行免疫荧光染色，可以获取每个标记染色和差分干扰对比的图像，从而划定单细胞计数感兴趣的区域。

然后，可以使用 ImageJ 执行单细胞计数，以确定不同平滑肌肉细胞源群的丰度。例如，这些代表性横截面的纤维帽区的单细胞计数分析显示，使用抗IL-1 β抗体治疗的小鼠和接受同型匹配IgG控制的小鼠之间的纤维帽区域细胞组成存在显著差异。事实上，IL-1β的抑制与YFP阳性平滑肌细胞的减少和高蛋白-3阳性细胞的增加有关。

此外，观察到YFP阳性平滑肌肉大体阿尔法作用-正平滑肌肉细胞的数量减少。而平滑肌细胞衍生的YFP阳性高细胞-3阳性巨噬细胞的相对数量显著增加，在两个胸腔动脉位置。值得注意的是，IL-1β的抑制没有影响病变内骨质疏松细胞的总数，也没有影响平滑肌细胞衍生细胞或巨噬细胞衍生的软骨细胞的比例。

该协议旨在通过标准化组织收集、处理和分段等关键步骤以及单细胞计数，提高动脉硬化病变分析的严格性和可重复性。该协议可用于分析其他血管床，容易呈现动脉硬化病变，包括大动脉和大动脉根。