该程序的总体目标是提出一种优化的实验方法，将胚胎组织从鹅胚胎和鸡胚胎中分离。通过这项技术，我们获得了可用于基因表达研究和功能测定的纯胚胎组织。来自鹅和鸡胚胎的组织通过显微外科分离，在保持其生物特性的同时接受体外内酶消化。
分离后，三维保存的组织可用于高分辨率地形基因表达模式分析。这种方法对于详细描述胚胎区域的原位基因表达特别有用，否则传统方法无法进入。此外，转录组分析方法也可以应用于孤立的组织中，无需遗传标记，同时提供组织特定的高通量 omic 分析。
或者，两个物种的分离组织可以在体外器官测定中相关48小时。这种方法允许研究组织相互作用，因为鹅和鸡细胞可以被不同的核特征和分子标记区分。培养组织形成器官的能力可以通过奥沃测定进一步测试。
因此，这种方法是研究发育过程中复杂的组织相互作用和高度动态空间变化的有用工具，也有助于揭示特定胚胎区对器官形成的潜力。例如，本文描述了从孤立的胚胎组织中形成鸡-鸡嵌合胸腺。首先，第三和第四咽袋的内皮，潜在的胸腺基质被分离出的咽部区域，经过三天的发育。
然后，这个组织与能够支持其发育的间膜有关，即索马托普勒拉中皮。最后，组织异质特异性关联在体外和 ovo 中培养，形成嵌合胸腺。使用水平层流罩和消毒仪器和材料，在无菌条件下执行所有鸡蛋操作程序。
受精卵孵化，空气室朝上。首先，从孵化器中取出鹅卵。准备一个大的硅酸盐玻璃碗，里面装满了冷 PBS。
用弯曲的剪刀，用三天的孵化时间，在鸡蛋壳上敲击并切开一个圆形孔。使鸡蛋对面的孔变钝，用冷 PBS 将蛋黄转移到碗中。通过将葡萄球蛋白膜外部切割到外质血管，将胚蛋黄取出胚胎。
在薄钳的帮助下，将胚胎转移到一个装满冷PBS的小碗中，然后将胚胎移动到带黑色底座的培养皿中。删除包含第三和第四咽袋的咽部区域，如以前的 Jove SPA 结扎中所述。然后，将第三和第四咽拱区域转移到装满冷胰腺素的玻璃杯中，在冰上孵育一小时，进行酶消化。
请注意，酶消化的潜伏期取决于发展阶段。将玻璃盘放在立体显微镜下，使用支架中的两个微刀将内皮从第三和第四咽拱区域隔离。首先将咽带区域与后侧向上，在外部表面的内部显示内皮和外皮。
观察神经管的外皮、内皮、间膜、心管和心室部分。取出附着在咽内膜的后面的神经管和中皮。观察咽部、第四和第三咽袋以及心管的内皮。
与后侧向上，小心分离和去除咽拱之间的间旋，并暴露咽袋。在咽区域的另一侧执行此程序。取出附着在内侧最后部的间质，观察第四个咽袋。
后侧向上，观察左四四咽袋。继续取出附着在内侧最后部和第二个袋子上的电位。取出心管和内袋周围的凹塞。
与腹侧向上，观察咽内德姆，和第二咽拱的右侧。在此阶段，甲状腺基的内皮应该可见。分离第二和第三咽拱的外皮，小心地去除拱门的分膜。
观察右侧第二个咽拱的分部去除。注意第四和第三袋的位置和甲状腺基点。将遗骸取出到附着在咽袋的间质细胞中。
观察右侧的第三个和第四个袋子以及左侧的第四个袋子。重复左侧的分遣。现在观察左侧的第三个袋子。
观察左侧第二个拱门的分遣点。请注意，在此过程期间，所有表面和溶液都应保持冷。更改为新的冷胰腺素溶液和菜，以防需要很长时间来解剖组织。
最后，在第二和第三咽袋之间进行横向切割，以去除第二个邮袋和甲状腺基。此时，隔离的内侧由第三和第四咽袋和咽后尖端组成。在两个微型手术刀的帮助下，取出分离的梅森奇梅。
将分离的内皮转移到装满冷胎儿血清的玻璃盘中，在准备体外测定时将其放在冰上。鸡蛋被放置在水平位置，上侧标有使用木炭。首先，从培养箱中取出鸡蛋。
用弯曲的剪刀，在壳上打开一个小孔，插入一根针，用10毫升注射器吸两毫升白素。在壳体标记区域打开一个圆形孔，将葡萄球膜外部切割到额外的胚胎血管上，同时用薄钳将胚胎抱住。在立体显微镜下，将胚胎放在含有冷 PBS 的黑色基底的培养皿中。
使用四个昆虫针将胚胎固定到板的底部。将针脚放在外向区域，形成方形。在19和24的胚胎之间进行两次切割，横向到胚胎轴并穿过胚胎。
通过切割边缘胚胎边缘释放此部分。观察侧板、神经管和导管。吸气并转移组织到装满冷胰腺素的玻璃盘中。
在冰上孵育30分钟，进行酶消化。在立体显微镜下，使用支架中的两个微刀将中皮从周围组织分离。观察索马托普图拉中皮，splanchnopleura，神经管和异体。
首先，去除表面的外皮。观察与异体分离的索马托普图拉中皮。然后，小心地将位于喷孔的 splanchnopleura 从索马托普勒库拉分离。
观察索马托普图拉的右下层。通过与神经管平行运动切割释放它。请注意，在此过程期间，所有表面和溶液都应保持冷。
更改为新的冷胰腺素溶液和菜，以防需要很长时间来解剖组织。观察索马托普鲁拉、索米茨、神经管和外皮的左下层。重复这边的中皮释放。
用微刀做慢动作。暴露的细胞外基质蛋白通过组织和仪器，防止液体运动。小心地切断与神经管平行运动的索马托普图拉。
将分离的中皮转移到装满冷胎儿牛血清的玻璃盘中，在准备体外测定时将其放在冰上。将细网状金属格栅放在培养皿中，并填充培养介质。去除过量的液体，用格栅顶部对介质表面进行平表。
在薄钳的帮助下，将膜过滤器浸入培养介质中，并小心地将膜片放在格栅顶部，以与表面接触。在立体显微镜下，借助铲子和薄钳，通过轻轻滑动，将隔离的内侧膜从玻璃盘转移到膜过滤器。对隔离的中皮重复此过程。
在微刀的帮助下，混合组织，以最大限度地扩大其关联性。小心地将相关组织放在37度的加湿培养箱中，用5%的CO2放置48小时。孵育期后，将培养组织移植到科里奥兰型膜上，并允许其在椭圆形中再发育10天，完成上述器官形成。
下面是允许分离鸟类胚胎组织的后向法，用于不同的实验方法。例如，还评估了已知参与形成咽袋的基因的表达，评估了一种分离的内皮，含有鸡胚胎中的第二、第三和第四个咽袋，由整个坐骑原位杂交。声波刺猪的表达在中央咽的内皮中检测出来，排除在袋内，而BMP7在第二和第三咽袋的内皮中表达，排除在中央咽和四咽袋之外。
分离的组织也可以在体外特别关联48小时，移植到科里奥兰型膜上，并允许进一步发育10天。外植可以通过传统组织学和免疫组织化学进行分析。第三和第四咽囊与鸡索皮瘤的关联具有代表性的一些结果如下-Grafts显示，完全形成的嵌合胸腺与鹅衍生的胸腺上皮细胞对QCPN和鸡淋巴细胞呈阳性。
此外，细胞蛋白正胸腺上皮显示正常的形态特征，显示典型的视网膜结构。看完这段视频后，你应该有一个很好的理解，如何分离出可用于基因表达研究，通过形成嵌合器官，可以帮助破译器官遗传学的复杂性。
