通过遵循此协议，用户将能够生产高纯度的 AAV 向量，并生产适合体外或体内应用的 AAV 载体。该协议可用于生产和纯化一系列配置差异的 AAV 血清型。结合这两个元素对于获得细胞类型和组织特异性表达非常有用。
生产一些血清型可以给较低的产量。这是生产，有密切的血清型，应该单独评估。展示这些程序的将是雪莉弗里蓬特，一个技术人员从我们的实验室。
生长 HEK 细胞后，混合 360 微克的帮助质粒、180 微克质粒编码向量帽，以及 180 微克含有转基因的质粒，在 18 毫升 150 毫摩尔氯化钠中准备 DNA 混合物。将这种混合物分布在三个 50 毫升锥形管上。在一个新的锥形管中，混合840微克PEI和6毫升150毫摩尔氯化钠，为六个细胞培养皿准备PEI混合物。
然后，将六毫升的PEI混合物，滴滴，到含有DNA混合物的锥形管之一。在室温下孵育20分钟。接下来，从培养箱中取出六个细胞培养皿。
在层流罩中，从每道菜中完全吸出介质。用五毫升预热的 DPBS 冲洗盘子，以去除介质的痕迹。轻轻倾斜每个盘，以确保 DPBS 均匀分布在整个表面上。
然后，轻轻地吸吸 DPBS。在每道菜中缓慢加入12毫升DMEM，在菜边放置一个移液器。混合PEI和DNA混合物，通过上下移液三到五次。
以滴滴的方式将这种混合物的两毫升添加到六个细胞培养皿中，确保小心地将其分布到整个表面上。一次使用六个细胞培养皿重复此过程，直到达到 18 个细胞培养菜。轻轻摇动细胞培养皿以分配PEI DNA混合物。
在37摄氏度下孵育转染细胞，湿度为95%，二氧化碳为5%，为5小时。在此之后，在18个菜中每个菜中再加12毫升DMEM 10，而不去除预先存在的介质。在相同的条件下继续孵育转染的细胞。
在转染后72小时，使用细胞刮刀小心地将细胞从每个培养皿中分离出来。在15毫升圆锥管中收集两个培养皿的培养皿的培养和细胞，保存在冰上。在 420 倍 G 和 4 摄氏度下将管离心 10 分钟，离心机的加速和减速设定为最大值。
小心地将上流液从每管中丢弃，轻轻将其倒入废物处理容器中。然后，将含有细胞颗粒的管子放在冰上。我们将每个颗粒悬浮在两毫升的解液缓冲液中，通过上下移液 5 到 10 次混合。
将 AAV 从三个管子中拉出，一起。首先，将重新悬浮的细胞放入含有与乙醇混合的干冰桶中，将其冷冻。然后立即将细胞放在37摄氏度的水浴中，解冻细胞。
重复此冻结和解冻循环三次，以融化细胞并释放 AAV 颗粒。第三次解冻步骤后，离心机在1167倍G和4摄氏度15分钟。小心地转移超自然剂以清洁 50 毫升锥形管。
将核酸酶添加到每根管中，最终浓度为每毫升上一毫升50单位。在37摄氏度下孵育30分钟，同时每10分钟旋转一次管子，以确保核酸酶与上清液彻底混合。在13490倍G和4摄氏度的离心机20分钟，以澄清上清。
在此之后，取出 10 毫升注射器的柱塞，将 0.45 微米过滤器连接到注射器上，并将其放在干净的 50 毫升锥形管上。小心地用澄清的上一位液填充注射器。使用柱塞强制通过过滤器的 lysate。
接下来，在四个独立的50毫升圆锥管中准备每个碘异醇馏分，如文本协议表之一所述。将8毫升15%的碘糖醇放入三个超离心管中。将 5.5 毫升的 25% 碘异醇放入干净的 50 毫升锥形管中。
使用非分级巴斯德移液器，在 15% 的碘异醇溶液下小心地将 5.5 毫升的 25% 碘异醇溶液层下。添加文本协议中描述的 40% 和 60% 的解决方案。碘异醇分数不应在分层上混合。
使用巴斯德移液器，将粗液酸盐层对15%的碘盐梯度进行分层，一滴一滴地，以避免干扰粗液酸盐和碘盐溶液之间的界面。将每个超离心管填充开解缓冲液，直到半月板到达管颈底部，以确保管在超离心过程中产生的极高力下不会坍塌。使用适当的盖子关闭管子。
使用数字刻度，确保所有三个超离心管具有相同的重量。必要时调整重量，在粗液解体上添加更多的解液缓冲液。使用固定角度钛转子，在 301580 倍 G 和 12 摄氏度下用最大加速和减速将管离心 1 小时 40 分钟。
接下来，将针头连接到五毫升注射器上。从转子中的管子上拆下气塞，并在离心后回收管。只吸吸含有矢量粒子的40%碘盐分数。
处理样品或将其存放在摄氏四度。在这里，演示了一个协议，可用于生产具有各种帽、基因组配置、启动子类型和转基因货物的 AAV 载体。在此示例中，我们生成并纯化了两种不同的 AAV 载体，这些载体表示来自自免费基因组的绿色荧光蛋白。
这两个向量由不同的大写字母区分:PHPB 和 AAV9。他们通过尾静脉注射被送到成年C57黑六只小鼠体内。为了评估注射三周后的转基因表达水平，各部分染色有针对GP的初级抗体，使用与荧光染料结合的二级抗体进行检测。
荧光强度测量显示，当使用 PHPB 矢量相对于 AAV9 时，GFP 表达式显著增加。在脑、小脑和脑干中观察到GP的增加。准确收集包含分数的矢量对于此协议至关重要。
如果这样做不正确，矢量产量以及矢量纯度将受到不利影响。由于能够产生AV载体，小型实验室将能够利用许多实验可能性在中枢神经系统中传递基因。该协议要求使用超离心水，并且必须在处理此操作之前接受适当的培训，以避免事故。
此外，AAV病媒通常被归类为生物危害，因此，在处理和管理它们之前，您应该参考当地法规。
