化学抑制剂库筛选 t 细胞受体信号的中介识别

我们的高通量测定为识别小分子及其目标添加了可用于调节 TCR 信号和 T 细胞活化的方法。我们的检测通过过滤出有毒化合物和识别TCR信号和刺激诱导凋亡的抑制剂，具有自我矫正的一面。TCR信号的调停器的识别有助于免疫疾病治疗的发展。

我们为来自TCR-多克隆小鼠的胸腺细胞提供了强大的刺激。有可能使用TCR转基因小鼠，并刺激他们与其他肽配体三角体较弱的刺激。这种测定涉及使用小体积和小体积板来培养细胞。

这需要仔细处理板及其内装物。激酶抑制剂库中有许多化合物被认为是危险的。出于安全考虑，请将所有化合物视为同等危险，并遵循供应商建议的安全预防措施。

要开始使用激酶抑制剂治疗胸腺细胞，请使用多通道移液器将胸腺细胞每井添加40微升到小体积板中。把盘子放在冰上。然后移液将激酶抑制剂、DMSO 和二甲酮的一部分，以及完整 RPMI 介质的四个部分放入 96 井板中。

指定8口小体积板井进行未经处理的控制，4口井通过添加5微摩尔浓度的稀释的德沙米松，将0.5微升的稀释DMSO添加到车辆处理的控制中，对细胞死亡的细胞进行脱沙米松处理阳性控制。接下来，从抑制剂板的相应孔中，向96孔板中加入每个稀释抑制剂的0.5微升。要开始胸腺细胞刺激，首先确保抗CD-3和CD-28珠子均匀地重新悬浮。

接下来，用两毫升的PBS缓冲液清洗一毫升的珠子。将管子放在磁性支架上，将珠子与上经分离，吸出溶液。然后将珠子重新悬浮在完整 RPMI 介质的一毫升中。

在每个抑制剂处理的样品、4个DMSO处理样品和8个未经处理的样品中，每个井中每井增加10微升。在其余四口未经处理的油井中加入 10 微升完整的 RPMI。使用微孔板轨道摇床轻轻搅拌板。

接下来，在37摄氏度和5%的二氧化碳环境中孵育胸腺细胞17至20小时，或过夜。提供自动层流板清洗器，首先使用150毫升乙醇Tween溶液，然后用除去水补充1%Tween 20，最后用FACS洗涤缓冲液。在使用板洗涤器系统进行孵育结束时，使用 FACS 洗涤缓冲液使用 9 次洗涤周期清洗板。

每次洗涤通过层流添加和去除 55 微升的洗涤缓冲液，从而对井中的试剂进行指数稀释。要染色表面抗原，首先稀释一单位体积的抗CD-3、抗CD-4、抗CD-8和抗CD-69抗体在100个单位的FACS洗涤缓冲液中。然后将细胞重新悬浮在染色抗体混合物的25微升中。

使用微孔板轨道摇床轻轻搅拌板，然后将板放在冰上 30 分钟。要修复细胞，请先使用 55 微升的 FACS 洗涤缓冲液清洗板，如前所述，使用 9 次洗涤周期。然后向每一井添加50微升的固定渗透缓冲液。

混合好，在冰上孵化盘子30分钟。孵育后，准备一×X的法度，并在225毫升超纯水中稀释25毫升的10倍库存，洗涤缓冲液。用一 X 缓冲器为板垫圈镀上，并使用前文所述的 9 次洗涤周期用 55 微升的 1-X 缓冲器清洗板。

首先，将一毫升的抗卡帕斯3抗体与两毫升的1-X施用和洗涤缓冲液混合。每井向固定细胞中加入25微升。使用微孔板轨道摇床轻轻搅拌板。

把盘子放在冰上一小时。在孵育结束时，用一 X 法垫和洗涤缓冲液重复洗涤步骤九次。然后将 25 微升的 FACS 洗涤缓冲液添加到板的所有孔中。

上下移液几次，混合解决方案。最后，将混合样品转移到微刺激管中。用 FACS 洗涤缓冲液将管起，总体积为 200 微升，然后进行流式细胞仪分析。

在抗CD-3、CD-28刺激之后，在未经处理的样品和DMSO模拟处理样品中观察到，caspase-3活化和TCR降低调节作用均增加。此外，在两个受刺激的样品中观察到CD-69表达增加。经过脱毒处理的样品显示，独立于CD-69的启动作用，caspase-3活化增加，如预期的独立凋亡诱导效应和TCR刺激。

T细胞活化现象的选择性损伤由不同的抑制剂显示，这些抑制剂要么抑制了卡斯帕塞-3活化和CD-69上调节，要么抑制了CD-69的上调节，但并没有损害卡斯帕塞-3活化。也有抑制剂没有针对TCR信号通路的相关激酶，因此没有抑制CD-69上调节和卡斯帕塞-3激活。凋亡阳性对照的葡萄球菌素的屏幕结果显示，如预期的那样，其卡斯帕塞-3激活水平很高。

然而，结果也显示CD-69表达水平低，可归因于其中化抑制蛋白激酶C或其诱导凋亡之前CD-69表达。不同测定方案的比较表明，负对活性卡斯帕塞-3、CD-69和TCR染色、细胞死亡阳性控制、车辆控制和抑制剂处理样品无差异。预孵化阶段是为了便于使用小体积板来培养细胞。

手稿中还提供了标准的离心相关协议。潜在的有趣抑制剂或靶点可以使用不同的细胞类型和不同的物种，如宝鼠淋巴细胞或人类原细胞验证。随后对已识别分子和靶点进行表征有助于增进对T细胞生物学的理解，并扩展免疫调节的可能靶点。