大鼠骨髓破骨衣原体的分离、纯化及鉴别

此方法很重要，因为它可用于在体外获得大量完全分化的骨质。与传统方法相比，这种方法的主要优点是，它更稳定、更安全，在更少的时间和更少的努力中分离骨髓。该技术可以提供稳定的骨质疏松来源，骨质代谢疾病是骨代谢疾病的重要对象，包括骨质疏松症、帕罗顿炎和肠胃骨解病。

稍作修改后，此协议也可用于获取从大鼠或其他动物的细胞中提取的各种骨髓。首先，将安乐死动物放在消毒板上，放在一个上一个位置上。使用无菌剪刀，在近近股骨上做一个大约一厘米长的切口，以剥皮。

接下来，解剖股骨和头骨。小心而轻柔地切割臀部、膝盖和脚踝关节周围的双边连接部分，以隔离头骨和股骨。切断骨头周围的部分组织，确保彻底。

然后，将清洁的骨头放入一个五毫升的完整培养培养的盘子中。用无菌剪刀切掉长骨。使用一毫升注射器针用 10 毫升完整介质小心冲洗骨髓腔，直到骨髓腔变白。

将这种细胞悬浮液转移到50毫升管中，用70微米滤株过滤，以去除剩余的组织。加入五毫升红血解液缓冲液，在冰上孵化细胞8分钟。在此之后，将细胞在250倍G下离心5分钟，以产生细胞颗粒。

吸升液，并在10毫升的完整介质中重新暂停细胞。使用血细胞计计算细胞，并计算为此方法执行操作所花费的时间。首先，将安乐死动物放在消毒板上，放在一个上一个位置上。

使用无菌剪刀，在近近股骨上做一个大约一厘米长的切口，以剥皮。接下来，解剖股骨和头骨。切断骨头周围的组织部分，虽然没有必要完全切除组织。

用12毫升PBS冲洗头骨和股骨，然后切成两半。将被狙击的头骨和股骨放入准备好的一毫升移液器尖端，并放入准备好的微型离心管中。在1000次G和4摄氏度下将管离心三次，45秒。

在此之后，从管中取出含有骨骼的移液器尖端，将骨髓留在管中。将 200 微升 PBS 添加到管中，并反复上下移液器，彻底分解骨髓。将这种细胞悬浮液转移到50毫升管中，用70微米滤株过滤，以去除任何剩余的组织。

然后，使用血细胞计计算细胞，并计算在本节中所走的步骤所花费的时间。将六毫升细胞分离溶液加入无菌硅化离心管。将稀释的细胞悬浮液加入管中。

添加悬浮液后，细胞层和分离溶液之间将出现一个明确的限制。接下来，以 45 度角将移液器尖端粘附在管内表面。在水平离心机中，以 500 倍 G 将分层溶液离心 30 分钟。

在此之后，从上到下吸吸包含目标单元格的多云第二层。将目标细胞转移到新管。加入5毫升PBS清洗细胞，以250倍G离心5分钟。

通过添加 PBS 和离心，重复此洗涤过程，总共进行三次洗涤。用骨髓诱导培养重新吸血细胞颗粒。使用血细胞计计算细胞数。

然后，加入5至8毫升的骨髓诱导介质，获得每毫升30万个细胞的最终细胞溶液。在24井板的每个井中加入一毫升的细胞溶液。在37摄氏度下孵育细胞24小时后，轻轻吸气，并在每个井中加入一毫升的骨质诱导介质。

轻轻搅拌盘子，然后返回孵化器。每48小时，从每一井取出并更换0.8毫升的骨细胞诱导介质。轻轻搅拌盘子，然后再将盘子返回到孵化器中。

要开始预处理骨片，请使用微型电锯将新鲜的牛股骨皮层沿着纵轴切割成两厘米厚的切片。切割和研磨切片后，将切片浸入脱压水杯中清洗切片，并以 100 赫兹进行超声波检查一小时。重复此洗涤过程三次。

将洗净的切片浸入75%酒精中两小时。然后，吸出酒精，在干净的平台上将每一张切片片暴露在紫外线下一小时。要开始对蓝色染色，请将预处理的骨片放入24孔板的孔中。

在此之后，将培养培养中等到24井板中，将骨片浸入两小时。植物和诱导细胞，如前面证明。在四到六天出现骨质疏松后，用一毫升0.25摩尔氢氧化铵洗涤切片。

将切片进行三次声波化，每次五分钟，以去除活细胞，并允许分析骨片上的吸附坑。然后，去除氢氧化铵，用每片1%托利丁蓝色溶液一毫升染色两分钟。用 PBS 清洗污渍切片。

随机选择五个视图，并使用图像分析软件对吸收区域进行半定量分析。首先，在室温下，用每片2.5%谷胱甘肽的一毫升为骨片前缀两个小时。用一个氢氧化铵对前缀切片进行三次声波化，每次三分钟，以去除细胞。

然后，取出氢氧化铵，用PBS洗三次骨片，每次洗涤持续12分钟。在室温下用1%的振荡将洗净的骨片固定两小时。执行文本协议中概述的乙醇梯度脱水。

在此之后，用乙酰乙酸酯代替乙醇15分钟。用金铂涂覆切片，然后通过扫描电子显微镜进行分析。在这项研究中，大量的骨细胞前体被分离、纯化并成功诱导成为骨细胞。

通过补充M-CSF和LFL，巨大的骨质在五至六天被看到。这些骨质的形成通过陷阱染色成功识别。大细胞和紫色细胞被视为具有多个核的 TRAP 阳性细胞。

通过这种方法，在24个井板中，通常获得800个骨质原，每骨细胞含有多达30个核。与传统方法相比，这种改进的方法整个隔离过程可节省约 20 分钟。使用骨片评估骨吸收的活性是典型的体外方法。

通过托卢伊丁蓝色染色，吸附区域被可视化为浅绿色。通过扫描电子显微镜可以清楚地观察到骨坑的结构和特性。CTR是骨细胞特异性细胞标记之一，对于识别骨细胞和研究骨细胞的形成至关重要。

CTR 的正表达可以清楚地识别骨细胞，并将其与巨噬细胞多核生物区别。在免疫荧光测定中，CTR以绿色明确指示，而蓝色则表示细胞核。确保股骨和头骨不骨折，以避免失去骨髓。

以前从未执行过这种技术的人，在帮助细胞操作解决方案时可能会挣扎。移液器尖端必须粘附在管内表面，并保持在内表面 45 度角。