新鲜分离和内联小鼠脑内皮细胞内钙和膜电位的同时测量

该方法有助于回答脑血管生理学领域与慢性病衰老和发育过程中脑血流调节有关的关键问题。该技术的主要优点是，它允许在生理条件下同时测量脑动脉内膜内钙和膜电位。为了隔离老鼠的大脑，在显微镜下去除头骨上的皮肤和头发。

并去除过量的血液与冷无钙PSS。接下来，仅使用标准解剖剪刀的尖端进行切口。从腹骨开始，一直延伸到头骨的鼻骨。

然后沿着切口小心地打开她的头骨，用粗尖钳子分离结缔组织来暴露大脑。用冷的无钙PSS轻轻清洗分离的大脑，用烧杯去除血液。将脑腹侧放在包含冷解剖溶液的腔室中，用于分离脑动脉。

为了隔离脑动脉，通过将两个不锈钢针插入玻璃培养皿底部的木炭注入硅聚合物涂层，将分离的大脑固定在冷解剖溶液中。随后，手术分离后脑动脉约0.3至0.5厘米段从后交流和罗勒动脉。使用不锈钢针脚在 Petri 盘中的解剖溶液中固定两个隔离的后脑动脉。

然后，使用锐化细尖钳去除结缔组织，小心地清洁孤立的后脑动脉。将完好无损的动脉切成一到两毫米的段，进行酶消化。在此过程中，使用显微镜、照相机和铝制舞台准备三位一体，以固定腔室和微操纵器。

将微丝带与舞台和试样相邻的泵控制器固定。接下来，用矿物油完全回填滴定移液器，并固定在微西林格活塞上。然后使用与泵控制器的微西林格将大约 130 纳米升分离溶液提取到移液器中，同时确保没有气泡。

随后，将完好的动脉段放入一毫升分离溶液中，所需浓度的酶放入10毫升玻璃管中。在34摄氏度下孵育10至12分钟，进行部分消化。消化后，用五毫升新鲜分离溶液代替酶溶液。

使用一毫升移液器，在室温下将一段转移到含有分离溶液的腔室中。接下来，将移液器放入腔室中的分离溶液中，将其靠近消化容器的一端。在泵控制器上设置 2 到 5 纳米升/秒的速率，以进行温和的三角化。

同时通过100倍到200倍的放大率提取和弹出动脉段分离平滑肌肉细胞，同时产生内皮管。如有必要，请小心使用细尖钳子，将分离的切龙体和内部弹性层从内皮管中分离。确认所有平滑的肌肉细胞都分离，并且只有内皮细胞保持为完整的管。

使用微操纵器，使用硅酸盐玻璃固定移液器将内皮管的每一端固定在超级熔管的玻璃盖滑道上。从腔室中洗掉分离的机度和平滑的肌肉细胞。用两个摩尔多的氯化钙PSS代替分离溶液。

将移动平台与安全内皮管转移到超输液和实验钻机的显微镜上。然后在实验期间使用六个清洁的50毫升储液罐连续输送PSS和各自的药物溶液。使用直通流量控制阀手动将流量设置为与层流一致，同时将流量馈送与真空吸力相匹配。

在记录背景数据和染料加载之前，将 PSS 送到腔室进行内皮管的超融合至少五分钟。要同时测量膜电位与细胞内钙浓度，拉一个尖锐的电极，并回填两个摩尔氯化钾，以记录从细胞加载毛皮-2染料。为了研究通过染料转移进行细胞内耦合，用溶解在两个摩尔氯化钾中的0.1%碘化基回填微电子。

接下来，将电极放在用微操纵器固定在电表头台的移液器支架上，将电极放在涂有氯化物的银丝上。使用微操纵器将电极尖端短暂地定位到腔室中流动的 PSS 中，同时通过四倍目标查看。随后，将静膜电位设置为零，与接地浴电位一致。

如果需要，请使用与电表相连的可听见的基线监视器将声高与潜在录音关联。之后，使用 40 倍的镜目标将放大倍数提高至 400 倍，并将电极尖端放在内皮管的电池上。使用光度测量软件调整光度学窗口，以专注于大约 50 到 80 个内皮细胞。

然后使用微操纵器轻轻地将电极放入内皮管的一个单元中，等待至少两分钟，使静膜电位稳定下来。一旦静膜电位稳定在预期值，在没有光线的情况下打开荧光界面上的光电倍增管，开始通过刺激的 Fura-2 交替在 340 和 380 纳米，同时收集 510 纳米的荧光发射，获得细胞内钙浓度。一旦建立膜电位和细胞内钙浓度的同步测量，在药物应用之前，以恒定的层流速率，让内皮管以恒定的层流速率进行超输液约5分钟。

将 PSS 中准备的药物以恒定的流速应用于超级输液室。在药物治疗期间，同时测量F340/F380比率中的膜电位。实验完成后，将电极从电池中取走。

然后停止膜电位和细胞内钙浓度的分别记录，并保存文件进行数据分析。这是小鼠脑动脉内皮管的差分干扰对比图像，使用40倍的测量窗口进行实验调整。将锋利的电极放入电池中，如图像顶部所示。

以下是用于同时测量 F340/F380 比率和膜电位以响应 100 微摩尔 ATP 的原始痕迹示例。按照这个程序，其他方法，如共和荧光显微镜，可以执行，以回答有关微域信号的内皮钙，和活性氧物种的其他问题，例如。一般来说，这项技术将继续为细胞生理学的研究铺平道路，以探索血液和淋巴循环中的血管功能和衰老。