如何稳定蛋白质: 病毒 x 项目中热移检测和纳米差动扫描荧光测量的稳定性筛选

这种方法可以回答蛋白质化学和药物发现的问题，如哪些条件稳定蛋白质？哪些突变会影响酶的热稳定性？哪些配体与蛋白质靶点结合？

该技术的主要优点是，它速度快，易于在标准实验室中执行，非常适合中高通量应用。使用多通道移液器将蛋白质样品将稳定屏幕每种条件的10微升转移到96井板的相应井中，以节省时间。然后在适当的缓冲系统中准备每毫升约一毫克的一毫升蛋白质溶液。

如果进行热移检测，将 SYPRO 橙染料添加到蛋白质样品中，最终浓度为 20 倍。通过反转或短暂的漩涡混合。现在，将10微升的蛋白质溶液转移到96井板的每个井中。

在 600 次 G 下密封并离心 96 井板两分钟，以确保蛋白质样品和屏幕组件混合。重新密封稳定屏幕深井块和存储屏幕在四摄氏度长达四个月。要执行 TSA 实验，请通过用力按抽屉右侧的缩进打开样品抽屉。

将 96 井托盘放在 RTPCR 系统中，左侧有 A-1 井。单击新的实验按钮开始设置 TSA 实验。在"实验属性"选项卡中，当询问时单击"融化曲线"选项，您要设置什么类型的实验？

然后，当询问时单击其他选项，您希望使用哪些试剂来检测目标序列？在"板设置"中，定义目标和样本选项卡，输入目标名称，然后将处理程序设置为 ROX。和昆彻作为无。

在"板设置"中，"分配目标和样本"选项卡中，设置以"无"作为被动参考的染料。在同一选项卡中，将 96 井板的每个井分配给上一步中输入的目标名称。在"运行方法"选项卡中，删除步骤，直到总共有三个步骤。

将第一步设置为 25 摄氏度，斜坡速率为 100%，时间为 5 秒。将第二步设置为 95 摄氏度，斜坡速率为 1%，时间为 1 分钟。最后，将第三步设置为 95 摄氏度，斜坡速率为 100%，时间为 5 秒。

选择使用"收集数据"下拉菜单或单击数据收集图标收集数据。将每井的反应量设置为 20 微升。单击"开始运行"按钮开始 TSA 实验。

NanoDSF 可用于探测蛋白质的热稳定性，而无需使用外在染料。样品可以像协议前面所述的96个井板中准备，但无需添加任何SYPRO橙色染料。按"打开抽屉"按钮打开样品抽屉。

确保设备清洁，特别注意样品架附近的灰尘。如果系统有背面散射镜清洁它使用乙醇和无绒组织。通过接触毛细管的一端，从 96 井板的每个井中用大约 10 微升来加载毛细管。

然后将毛细管放入样品架的相应毛细管支架中。注意不要用指纹污染毛细血管的中间，因为这可能会干扰整个实验的荧光读数。用磁性密封带固定毛细管。

通过按"发现扫描"选项卡中的"开始扫描"按钮，启动初步扫描以检测每个毛细管的位置和强度。增加或减少事件激发强度，从初始功率10%，直到每个毛细管扫描的峰值在4000至12000单位之间。在"熔融扫描"选项卡中，通过将"温度坡度"选项设置为每分钟 7.0 度来进行熔融扫描。

开始温度到 25 摄氏度。结束温度达到95摄氏度。然后按"开始熔化"按钮启动 nanoDSF 实验。

重复这些步骤，为完整实验准备示例。设置完整实验后，导航到"熔化扫描"选项卡，然后通过将"温度坡度"选项设置为每分钟 1.0 摄氏度来编程熔融扫描。开始温度到 25 摄氏度。

结束温度达到95摄氏度。最后，按下"开始熔化"按钮，启动 nanoDSF 实验。T m 用作基准中蛋白质热稳定性的定量测量值，以比较不同条件的可偏向性。

此处显示的样品结果来自盐屏，体现了氯化铵对解酶的热稳定特性。将 Lysozyme 的 T m 值与 pH 屏幕进行比较后发现，TSA 和 nanoDSF 之间的一致通常是好的，但 nanoDSF 显示，在略大于 T m 的移位中，有一种识别稍高 T m 值的倾向。pH 值的降低使稳定性增加的趋势是一般趋势。

使用具有相同 pH 值的不同缓冲系统获得的 T m 值的范围可能很大。对于从每个稳定屏幕产生最高TSA T m值的条件的Lysozyme组合，测试以探寻协同组合效果。随着缓冲区系统更多组件的添加，T m 值普遍增加。

当缓冲区的单个组件经过优化并结合稳定性屏幕时，可能会产生明显的协同影响。遵循这项技术，其他方法，如结晶，可用于确定蛋白质的三维结构，并解开配体结合的分子基础。作为 Virus-X 项目的一部分，我们还提供蛋白质稳定性的洞察，该技术适用于广泛的药物发现和开发系统。