应用短暂的中脑动脉闭塞小鼠模型评价甘草提取物的神经保护作用

该方法有助于回答神经科学和传统口腔医学研究领域有关与模型相关的神经保护天然化合物筛选的关键问题。该技术的主要优点是，感染体积的较高可生产性符合缺血时间剂量。这种方法的视觉演示至关重要，因为使用无菌显微镜将非常薄的机具插入原始中脑动脉是典型的。

演示这个程序的将是Se-EunLee，一个在我的实验室学习的小学生。要准备乙二烷和Rhizome提取物，或GRex，首先添加200克的乙二烷和Rhizome，或GR，到两升甲醇，在室温下孵育五天。在孵化结束时，通过0.26毫米厚的滤纸和5微米孔径对溶液进行应变。

将GR残留物加入一升新鲜甲醇中，然后再次过滤溶液。将两种滤纸混合，并通过一张新的滤纸进行应变。然后在冷冻干燥前将萃取物浓缩在真空中，以产生GRex。

为准备GRex进行管理，将冷冻干燥的产品溶解在二甲基硫化物中，用0.9%的生理盐水稀释混合物。然后通过0.45微米注射器过滤器过滤溶液， 将DMSO的最终浓度调整到5%以下 建立小鼠中脑动脉闭塞模型（MCAO），确认麻醉的6周大22至25克雄性C57BL/6小鼠对尾部刺激缺乏反应，将鼠标放在36.5摄氏度的体温保持毯上，与温度计相连。通过剃须和脱毛霜去除小鼠胸部和颈部的所有头发后，将鼠标放在立体显微镜下，并在颈部中心进行两厘米的皮肤切口。

小心地将左普通胡萝卜动脉、外皮动脉和内胡萝卜素动脉的分支与周围的结缔组织分离，并使用4.0丝状缝合线将外型胡萝卜状动脉和具有半钩结的常用胡萝卜动脉缝合，以暂时阻断流入内胡萝卜状动脉的血流。插入0.1至0.12毫米厚11毫米厚的硅胶涂层8.0单丝4.0丝线，通过内侧胡萝卜动脉到左中脑动脉的起源，并使用激光多普勒流量计测量相对脑血流动脉的减少。将插入的灯丝固定到血管上两个小时，同时将脑动脉闭塞。

在闭塞期结束时，小心地提取灯丝，以恢复血流22小时的再灌注。并使用3.0丝线缝合的皮肤在五个地方用两个半打结。然后将鼠标返回到其笼子进行麻醉恢复。

再灌注结束后一小时，仅口服量，每公斤体重GRex300毫克。MCAO发病24小时后，在每只实验动物的头部中皮上切开一个切口，用倾斜钳子打破骨骼，同时剥去杜拉母体。小心地将大脑从头骨中分离出来，并使用小鼠大脑矩阵将切除的组织切成一毫米厚的部分。

根据标准协议，在 2%TTC 解决方案中染色部分 17 分钟。在用数码相机成像样品之前，将部分固定为 10% 的甲醛至少 2 小时。然后使用 ImageJ 分析和量化每个部分的脑梗塞区域。

在适当的实验时间点后，MCAO，用10毫升PBS将每个安乐死实验动物转接，然后用10毫升4%的甲醛进行转接。隔离大脑后，正如刚刚证明的，将收获的器官浸入10毫升的30%蔗糖中过夜。第二天早上，将脑组织样本嵌入最佳切温化合物中。

将组织切成15微米厚的细胞统计部分。将部分安装到玻璃幻灯片上，将部分在 80%乙醇中淹没 1 分钟。对于 H&E 染色，用赤氧林溶液标记样品 5 分钟，然后用 1% 酸醇滴两次。

接下来，将幻灯片浸入饱和碳酸锂溶液中 30 秒，然后用自来水洗涤 30 秒，使用 Eosin 溶液进行 30 秒的反染色。用自来水洗涤去除多余的Eosin溶液，并在95然后用100%乙醇中一分钟上升浸入脱水。然后，对滑梯进行通风，用二甲苯清除至少 10 分钟，然后用安装介质安装盖玻片。

对于氯霉素紫罗兰染色，将80%乙醇处理的幻灯片放在滑轨加热器上至少一小时，然后浸入50%乙醇中，用氯仿稀释过夜。第二天早上，在40摄氏度的干烤箱中用0.1%的紫光染色10分钟，随后在95%乙醇中脱水30分钟，两次5分钟100%乙醇浸泡。接下来，清除幻灯片两个五分钟的二甲苯浸入，然后空气干燥。

然后使用安装介质安装幻灯片，通过光显微镜进行可视化。在假操作的正常群体中，没有观察到脑梗塞;而在控制中，未经治疗的MCAO动物，观察到相对广泛的受损区域。在每公斤300毫克的GRex治疗模型小鼠中，观察到受损组织在统计学上显著减少。

H&E和紫红色色组织部分的组织学分析提供了细胞存活率的指标。事实上，H&E和紫红色染色强度显著降低对照，未经处理的MCAO组相对于假操作的正常组。另一方面，经过GRex治疗的动物表现出更大的组织完整性，这意味着神经元细胞死亡比对照组、未经治疗的组和假操作组都少，这表明提取物对缺血再灌注引起的脑损伤具有强大的神经保护作用。

在尝试此程序时，重要的是要记住在此期间监测相对小脑血流量。和工艺导体非常小心，以尽量减少对内皮层的损害。