斑块测定:确定病毒性皮石为斑块形成单位（PFU）的方法

1. 设置

1. 在开始任何涉及微生物的工作之前，请确保工作空间已消毒（例如，用 70% 乙醇擦拭）。始终穿着实验室外套和手套，保持长发绑在背上，并确保任何伤口都特别好保护。
2. 完成后，对所有表面进行消毒，彻底清洗/消毒手和手腕。

2. 议定书

1. LB 介质准备
   注意:根据宿主细菌菌株和噬菌体的不同，不同的液体介质可能更适合于宿主细菌菌株的初始培养，或者不同的固体介质可能更适合后续生长。莱索根汤 （LB） 用于此协议中的肉汤和琼脂。
   1. 混合 4 g LB 在 200 mL 蒸馏水中，在三重，为 LB 肉汤， 固体底部琼脂， 和软顶部琼脂.所有解决方案都应在容器中制备，其容量应为最终体积的两倍，以防止高压灭菌时溢出。
      注意:如果以三重分法执行测定，则准备将 LB 底部琼脂的量翻倍。
   2. 根据需要，使用 NaOH 或 HCl 将所有三种解决方案的 pH 量调整为 7.4。
   3. 在底部琼脂瓶中加入 3 g 的琼脂能量，为固体琼脂制作 1.5% 的琼脂溶液
   4. 在顶部琼脂瓶中加入 1.2 g 的琼脂能量，使软琼脂的琼脂溶液为 0.6%。
   5. 将装有半紧固盖的瓶子放入设定为 121°C 的高压灭菌器中 20 分钟，对溶液进行消毒。运行完成后立即关闭盖子，以防止污染。
   6. 当 LB 介质温度达到约 45-50°C 时，在 200 mL LB 溶液中加入 450 μL 无菌 1 M CaCl_2，最终浓度为 2.25 mM。
   7. 将固体琼脂介质的15 mL等分倒入无菌培养皿中（避免晃动以防止发泡），让琼脂在室温下凝固数小时或过夜（图4A）。板材可在4°C上下倒存储数天。
2. 宿主细胞的培养
   1. 在测定前一天，将10μL的大肠杆菌培养剂加入10 mL的LB汤中。
   2. 在摇动的培养箱中，在37°C下以160rpm在160rpm下孵育细菌。
   3. 在测定的早晨，将0.5 mL的过夜培养添加到10 mL的新鲜LB中。
      注意:如果要在三次测定中执行测定，请准备此区域性的两倍。
   4. 在摇动的培养箱中以160rpm在37°C下孵育，直到细菌培养处于对数阶段生长。这可以通过 0.5-0.7 的 OD600 分光度来确定。
   5. 将培养物保持在室温下，直到细菌被添加到顶部 LB 琼脂。
3. 噬菌体10倍的连续稀释
   1. 将 180μL 的 LB 肉汤添加到 a 第一行的 7 口井中，以 96 孔板
      注意:建议对三联产品进行稀释，以提高其统计可靠性。为此，在板的第二行和第三行准备噬菌体的额外稀释剂。
   2. 小心地涡涡原噬菌体样品，以确保均匀性，并将20μL转移到第一口井中。
   3. 通过移液和向下混合样品。
   4. 将产生的悬浮液的 20 μL 转移到第二口井中。
   5. 继续连续稀释，将第二口井中的20μL溶液转移到第三口井，等等，直到第六口井，留下第七口和负对照，不会添加噬菌体悬浮液。这将创建 10^{-1 -10-6}的稀释范围。
4. 电镀
   1. 用名称、日期和简短的样品描述（包括噬菌体样品稀释因子）标记培养皿的底座（以前在步骤 2.1.7 中准备）。在测定前一小时在37°C培养箱中预热培养皿。
   2. 融化凝固的软琼脂介质（通常使用微波进行;凝固的琼脂在85°C下熔化），并让它接近45°C。加热介质可置于 45°C 水浴中，约 1 小时，达到适当的温度。它应该足够热，以保持液体形式，但足够凉爽，不杀死添加的细菌。
   3. 将 4 mL 细菌培养物（从步骤 2.2 起）与 35 mL LB 软琼脂混合（在 45°C 下）。旋转均匀分布细胞，但避免晃动，以防止发泡 （图4A）。
   4. 为每个连续稀释步骤标记一个无菌试管，为控制样品标记一个无菌试管，总共标记 7 个试管。将细菌培养剂/软琼脂混合物的5 mL等分从步骤2.4.3放入7管中。通过步骤 2.4.6 快速工作，因为这种小体积的基于琼脂的介质将在室温下迅速凝固。
   5. 将 100 μL 的控制样本（从步骤 2.3）添加到控制试管中，并小心旋转。丢弃用过的移液器尖端，并将相同的体积从每个序列稀释的噬菌体样品（步骤 2.3）传输到各自的试管，旋转混合。
   6. 立即将 5 mL 混合物转移到贴有标签的预热固体琼脂板上（图4A）。轻轻旋转板，甚至分散混合物。
      注意:如果要在三重中执行测定，请重复步骤 2.4.3-6 两次。
   7. 用实验室薄膜密封每个板，并在室温下（约15分钟）使两层正确凝固，然后再将其从37°C培养箱上侧放置，刺激细菌和噬菌体的生长，持续24小时或直到斑块发育，它通常需要大约1-5天的斑块出现（图4B），但时间差异很大，取决于孵育条件，培养和细菌物种。

3. 数据分析和结果

1. 计数斑块
   1. 确保标有"控制"的板中看不到斑块，因为这将表示病毒污染。
   2. 从^标有10-6的板开始，含有最稀释的噬菌体样本。在不取下盖子的情况下对斑块进行计数，在进行标记时用笔标记它们，以指示哪些斑块已计数。
   3. 计算剩余的盘子。有些盘子的斑块可能太少或太多，无法计数。使用带有 10-150 块板的板进行进一步分析。
2. 计算 PFU
   1. 将斑块数量除以稀释系数（例如，最稀释样品的10-6），以获得100μL噬菌体混合物中的斑块形成单位（PFU）数量。
      注意:如果以三联形式执行测定，则使用三个板的平均斑块数。
   2. 要确定原始样品的浓度（以PFU/mL为单位），再乘以10的额外稀释系数，因为只镀了100μL的样品。（即）
   3. 计算具有 10 到 150 块斑块的所有稀释液的 PFU/mL 的平均值，以获得更可靠的结果。