يركز بحثنا أو بحثنا الرئيسي على التنوع الميكروبي ، وعلم النشوء الجيني ، وتطبيقات التخمير ، مع التركيز على تنوع الخميرة ، والتكيفات ، وتحديدا في التطبيق الصناعي لبيولوجيا الخميرة. بالانتقال إلى هذه التطبيقات على وجه التحديد ، ندرس كفاءة التخمير وإنتاج النكهة وتحمل الإجهاد في الخميرة. لذلك ، ترتبط أحدث التطورات لدينا بعلم النشوء الجيني للخميرة ، خاصة من باتاغونيا.
ثم نستخدم هذا لتوليد خميرة الجعة الجديدة لتخمير البيرة ، لكننا نستخدم أيضا خميرة جديدة للبيرة منخفضة الكحول. إجمالا ، نستخدم تقنيات أوميك مختلفة وتطور تجريبي لتطوير هذه الخميرة الجديدة للتطبيقات البيولوجية. نحن نستخدم حاليا تقنيات مختلفة مثل تسلسل الجينوم ، وتسلسل الجينوم طويل القراءة ، وكذلك النسخ.
ثم إجمالا ، نستخدم هذه المعلومات لإجراء بعض التطور التجريبي للسلالات المختلفة التي لدينا ، ثم نحاول التحقق من صحة بعض التغييرات الجينومية باستخدام تقنيات كريسبر أو تقنيات تحويل الخميرة المختلفة ، وبهذه الطريقة ندخل في التفاصيل الجزيئية لتكيف الخميرة مع البيئات المخمرة. لذلك ، لدينا تحديان كبيران. أحدهما هو توليد خميرة جعة جديدة مع تخمير بيرة فعال ، والآخر هو عكس ذلك.
نريد الحصول على سلالات جديدة ، خاصة من باتاغونيا ، قادرة على إنتاج بيرة منخفضة الكحول. أود أن أسلط الضوء على نتيجتين رئيسيتين من مختبرنا. أحدها هو أننا نحدد أصل باتاغونيا لأم خميرة الجعة ، Saccharomyces eubayanus.
والآن قمنا أيضا بإنشاء العشرات من أنواع الجعة الهجينة الجديدة لتخمير البيرة. أعتقد أن هاتين هما النتيجتان الرئيسيتان لبحثنا. للبدء ، اختر عينة من رقعة سلالة الخميرة المحولة وقم بتلقيحها في وسط ببتون خميرة يحتوي على 5٪ جلوكوز و 200 ميكرومولار هيغروميسين.
احتضان المزرعة عند 25 درجة مئوية دون اهتزاز لمدة 24 ساعة. قم بتحديث الثقافات في وسط طازج بمعدل تخفيف من 1 إلى 10 قبل الحضانة لمدة 24 ساعة أخرى. اغسل الخلايا بوسط ببتون الخميرة الخالي من السكر ، ثم قم بتلقيحها في وسائط الاختبار بتخفيف من 1 إلى 10.
استكمل وسائط الاختبار باللوسيفيرين بتركيز نهائي يبلغ 3 مللي مولار ، ومع 200 ميكرومولار هيغروميسين للحفاظ على استقرار البلازميد. لاختبار نمو السكر المختلط ، استخدم مصفوفة الجلوكوز والمالتوز مع زيادة تركيزات الجلوكوز والمالتوز في وسط ببتون الخميرة. قم بتوزيع 200 ميكرولتر من الثقافة في كل بئر من لوح 96 بئر.
استخدم الآن قارئ لوحة مقياس الإضاءة لقياس اللمعان والكثافة البصرية عند 620 نانومتر كل 30 دقيقة لمدة 72 ساعة. اضبط وقت التكامل على ثانية واحدة وقم بتعطيل التوهين لضمان نشاط المبلغ المستمر ومراقبة كثافة الخلية. لأخذ عينات التخمير ومراقبة التلألؤ ، قم أولا بإذابة مستخلص الشعير في الماء لتحضير وسط مستخلص الشعير.
قامت سلالات الخميرة المحولة قبل الزراعة في 5 مل من وسط YPD عند 20 درجة مئوية مع التحريك عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. انقل المزرعة المسبقة إلى 50 مل من وسط مستخلص الشعير ، ثم احتضانها عند 20 درجة مئوية مع التحريك عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة أخرى. الطرد المركزي للثقافة عند 21 ، 380 جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة لحصاد الخلايا.
ثم أعد تعليق الخلايا في صفيحة 12 درجة من وسط مستخلص الشعير في ثلاث نسخ لمدة 50 ملليلتر من التخمير الدقيق. استكمل الوسط ب 0.3 ملليغرام لكل لتر من كلوريد الزنك لتحسين أداء التخمير. احسب حجم اللقاح لضمان كثافة الخلايا المتسقة عبر التكرارات.
تلقيح الوسط المحضر بالكمية المحسوبة من اللقاح. ثم ضع الثقافات على حرارة 20 درجة مئوية دون اهتزاز لمدة 14 يوما. راقب تقدم التخمير عن طريق تسجيل ثاني أكسيد الكربون المفقود يوميا.
قم بوزن الأوعية كل يوم لقياس فقدان الوزن التراكمي كمؤشر لإنتاج ثاني أكسيد الكربون. لمراقبة التلألؤ ، قم بأخذ عينة دورية من 200 ميكرولتر من كل تخمير دقيق. أضف لوسيفيرين لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 3 ملليمول.
قياس التلألؤ والكثافة البصرية عند 620 نانومتر باستخدام قارئ لوحة مقياس الإضاءة دون توهين وثانية واحدة من وقت التكامل. تم إنشاء بلازميد المراسل العرضي pRS426-PMAL32-LUC-HphMX بنجاح باستخدام محفز PMAL32 luciferase ORF ، و hphMX cassette. لوحظ نشاط لوسيفيراز تفاضلي بين السلالات الثلاث المحولة تحت تركيزات متفاوتة من الجلوكوز والمالتوز.
أظهر CBS12357T و CL467.1 تنشيطا بدون جلوكوز بينما تطلب QC18 تركيز جلوكوز أعلى من 1٪ للتنشيط. في ظل ظروف التخمير الدقيق ، أظهرت جميع السلالات الثلاث المحولة ذروة تلألؤ قوي في أوقات مختلفة. كان اللمعان غائبا في السلالات البرية.
