يركز بحثي بشكل أساسي على الفيزيولوجيا الكهربية الدماغية الدماغية. تصف هذه الدراسة طريقة لعزل خلايا العضلات الوعائية الأولية واستخدام تقنية مشبك قرصة الخلية بأكملها للمساعدة في خصائصها الفيزيولوجية الكهربية. عزل الخلايا الطازجة له قيود مثل تأثير درجة الحرارة على فصل الإنزيم ، وأوقات الهضم المختلفة للأوعية الدموية المختلفة ، والقدرة الفورية في البيئة الأصلية للخلايا.
بالإضافة إلى ذلك ، تمثل تقنية مشبك القرص تحديات في تمزق السقف والغشاء الذي يتطلب تشغيلا ماهرا. يتم إجراء أبحاث مرافق البروتوكول هذه في اكتساب الخلايا الأولية النشطة بسهولة من الشرايين اليدوية ويجب أن يرن بسرعة تطبيق تقنية مشبك القرص. للبدء ، املأ طبق بتري بمحلول ملحي فسيولوجي بارد مشبع بنسبة 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
ضع دماغ فأر معزول في طبق بتري. ضع الدماغ بطنيا لأعلى في طبق بتري وقم بتثبيته بالإبر. تحت المجهر الضوئي ، حدد موقع الشريان القاعدي.
باستخدام الأوتوكلاف والملاقط والمقص ، قم بإزالة الأنسجة المحيطة بعناية. بعد ذلك ، أدخل سلكا بطول سنتيمترين بقطر 25 ميكرومتر في الشريان القاعدي المعزول. افركي الجدار الداخلي للشريان برفق بالسلك لإزالة بطانة الأوعية الدموية بشكل فعال.
لعزل خلايا العضلات الملساء ، أولا ، قم بتسخين المحاليل مسبقا في أنابيب الاختبار من واحد إلى ثلاثة. نقل الشريان القاعدي المعزول إلى أنبوب الاختبار الثاني. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع حقن خليط من 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الأنبوب.
بعد ذلك ، انقل الشريان القاعدي من أنبوب الاختبار الثاني إلى أنبوب الاختبار الثالث واحتضانه. انقل ملليلتر واحد من محلول فصل الخلايا المسخن مسبقا من أنبوب الاختبار الأول إلى أنبوب الاختبار الثالث. استمر في حقن 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الحفاظ على المعالجة الأنزيمية لمدة ثلاث دقائق.
ثلاثي تحضير الشريان القاعدي لإطلاق الخلايا. بعد ذلك ، ضع الماصة أربعة ملليلتر من محلول الفصل البارد لأنبوب الاختبار الثالث لإنهاء العملية الأنزيمية. الطرد المركزي الخليط على حرارة 59 جم لمدة ست دقائق.
باستخدام ماصة ، تخلص من المادة الطافية. ثم أضف محلول الفصل البارد مرة أخرى. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة المادة الطافية.
اترك ملليلتر واحد من تعليق الخلية. قم بتخزين معلق الخلية عند أربع درجات مئوية لمدة ست إلى ثماني ساعات. انقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى الحمام.
أضف ملليلترا واحدا من السائل خارج الخلية إلى الحمام واتركه يرتاح. للبدء ، قم بتشغيل قطبي micropipet. ضع أنبوبا زجاجيا في القطبي.
في لوحة التحكم حدد البرنامج الأول. انقر فوق Enter والوصول إلى البرنامج الأول. الآن قم بإجراء اختبار منحدر بالنقر فوق المنحدر على لوحة التحكم لقياس القيمة الحرارية للأنبوب الزجاجي.
أدخل أنبوبا زجاجيا جديدا. ثم حدد البرنامج الأول، وانقر فوق Enter لتصنيع الماصة الدقيقة. لتسجيل تيار الرعاية ، قم أولا بتشغيل برنامج الحصول على البيانات.
حدد ملف، ثم انقر فوق تعيين أسماء ملفات البيانات لإنشاء مسار تخزين البيانات. قم بتمكين وظيفة اختبار الغشاء في قائمة الأدوات. ضع عينة من خلايا العضلات الملساء المعزولة من الشريان القاعدي للفأر في وسط عرض الكاميرا بالمجهر.
اغمر طرف السلك المرجعي في محلول الحمام. ثم املأ 20٪ من الماصة الدقيقة المصنعة بالمحلول داخل الخلايا. قم بتأمين الماصة الصغيرة المحملة على حامل قطب التسجيل.
الآن مع حقنة ، قم بالضغط الإيجابي. حرك طرف الماصة إلى محلول الحمام واضبط إزاحة الماصة على برنامج مضخم الإشارة لضبط خط الأساس الحالي على صفر بيكوأمبير. اضغط برفق على الماصة على غشاء الخلية.
لاحظ زيادة في مقاومة الختم لماغومي واحد على الأقل. قم بإزالة الضغط الإيجابي والضغط السلبي. لإنشاء مقاومة عالية ، مع مقاومة ختم لا تقل عن جيجوم واحد على الأقل ، اضبط جهد التثبيت على 60 مللي فولت تحت الصفر وتعويض سعة القطب الكهربائي باستخدام CP FAST و CP البطيء.
قم بتطبيق ضغط سلبي قصير لتمزيق غشاء الخلية ، وتشكيل تكوين خلية كاملة. حدد الخلية بأكملها في برنامج مضخم الإشارة. ثم انقر فوق تلقائي لتعويض سعة الغشاء.
قم بتحميل بروتوكول kir وابدأ تسجيل البيانات. تم عزل خلايا العضلات الملساء المعزولة حديثا مع مورفولوجيا المغزل. كانت الخلايا صحية ومناسبة لتجارب مشبك التصحيح.
أظهر تيار المعالجة النموذجي تصحيحا داخليا عند الفولتية السالبة مع الحد الأدنى من تدفق تيار أيون البوتاسيوم أو معدومه عند الفولتية الموجبة. كلوريد الباريوم بتركيزات 100 إلى 300 ميكرومول لكل لتر يثبط بشكل فعال نشاط قناة kir مما يؤكد التيار على أنه kir. زاد نيتروبروسايد الصوديوم من تيار kir مما يشير إلى دور قنوات kir في توسع الأوعية الناجم عن SNP.
أظهرت مقارنة علاقات الجهد الحالي انخفاضا في كثافة التيار في وجود كلوريد الباريوم ، وزيادة مع SNP.
