ينصب تركيز البحث طويل المدى على إيجاد علاجات محتملة للاضطرابات العصبية في متلازمة داون. وينصب تركيزنا الحالي على ضعف تكوين الخلايا العصبية لمتلازمة داون ، وهو سبب رئيسي للإعاقة الذهنية. وجدنا أن ضعف تكوين الخلايا العصبية لمتلازمة داون ناتج عن خلل في دورة الخلية ثنائية الطور ، على عكس الاعتقاد الشائع بأنه يرجع فقط إلى شيخوخة الخلايا السلفية العصبية لمتلازمة داون.
سيؤدي تحديد عيب دورة الخلية ثنائية الطور باستخدام البروتوكول البشري القائم على IPSC الموصوف في هذه المخطوطة إلى دفع الاستراتيجيات العلاجية المحتملة التنموية مع الأخذ في الاعتبار كل من حالة دورة الخلية التي تقلل من التكاثر في المرحلة المبكرة ، والفشل في الخروج من دورة الخلية في المرحلة المتأخرة. للبدء ، أضف 10 ميكرومولار من مثبطات الصخور إلى وسائط iPCS البشرية الكاملة ، و DPBS ، ومحلول انفصال الخلايا ، والوسط المكيف بالتغذية المكملة ب 25 نانوغرام لكل مليلتر من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية. قم بتسخين جميع الكواشف إلى 37 درجة مئوية.
خذ لوحة ستة آبار من iPSCs على مغذيات. ماصة المستعمرات المتمايزة, وإضافة وسيط iPSC البشري الكامل الطازج. ضع الطبق على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين.
بعد الحضانة ، اغسل الآبار مرة واحدة باستخدام DPBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم أضف ملليلتر واحد من محلول انفصال الخلايا إلى كل بئر. ضع الطبق على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 إلى 14 دقيقة.
راقب الخلايا تحت المجهر المقلوب. إذا كانت معظم الخلايا منفصلة ، ولكن إذا ظل بعضها ملتصقا ، فاضغط على اللوحة برفق من الجانبين. أضف ثلاثة ملليلتر من DPBS المكمل بالكالسيوم والمغنيسيوم في كل بئر لتخفيف محلول انفصال الخلية.
باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر، قم بإجراء سحب لطيف مرتين إلى ثلاث مرات لكسر التكتلات، مع تجنب الفقاعات. مرر الخلايا عبر مصفاة 40 ميكرومتر إلى جهاز طرد مركزي سعة 50 مليلتر 2. الطرد المركزي التعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق عند 200 G.استخدم نظام الشفط الفراغي لشفط الوسائط برفق.
الآن, أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من وسيط iPSC البشري. انقل جميع الخلايا المعلقة إلى طبق طوله 15 سم مغطى بجيلاتين 0.1٪ ، واحتضانه في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. جمع الوسائط مع الخلايا في جهاز طرد مركزي 2.
جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق عند 200 جم ، ثم قم بشفط الوسائط برفق باستخدام نظام الشفط الفراغي. أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من الوسط المكيف بالتغذية ، مع استكمال 25 نانوغرام لكل مليلتر من BFGF ، و 10 ميكرومولار من مثبط الصخور. بعد عد الخلايا ، قم بإعداد تعليق من 30 ، 000 إلى 50 ، 000 خلية لكل مليلتر.
بذر المعلق في طبق جيد. بعد يومين ، استبدل الوسط المكيف بوحدة التغذية بخلية السلف العصبية ، أو وسط NPC. قم بتغيير الوسائط في اليومين الثاني و 18 كما هو معطى.
في اليوم 28 ، استبدل الوسط الموجود في اللوحة بوسط NPC مكمل ب 10 ميكرومولار من مثبط الصخور. ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بشفط المادة الطافية ، واغسل الآبار مرة واحدة باستخدام DPBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم.
أضف ملليلتر واحد من محلول انفصال الخلايا في كل بئر. ثم راقب الخلايا تحت المجهر المقلوب بتكبير 4x. بعد ذلك ، قم بإدخال ثلاثة ملليلتر من DPBS المكملة بالكالسيوم والمغنيسيوم في كل بئر من اللوحة.
باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر، قم بعمل ماصة التعليق برفق، وكسر أي تكتلات. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر موضوعة فوق جهاز طرد مركزي سعة 50 مليلتر 2. جهاز الطرد المركزي ، والشفط كما هو موضح سابقا ، ثم أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط التمايز المحدد المكمل ب 27 بفيتامين A. عد الخلايا الحية باستخدام Trypan blue ومقياس الدم.
ثم قم بزرع 50 ، 000 خلية في كل بئر من صفيحة 48 بئر مؤهلة مطلية بالمصفوفة. في اليوم 33 ، استبدل الوسط في آبار الثقافة بوسط التمايز العصبي. لوحظ انخفاض كبير في الخلايا العصبية الإيجابية ل TUBB3 في مزارع متلازمة داون ، مقارنة بالخلايا euploid متساوية التكوين ، مع انخفاض مضاعف تقريبا في اليوم 85.
لوحظت نسبة أقل بكثير من الخلايا الإيجابية KI67 في مزارع متلازمة داون خلال المرحلة العصبية المبكرة ، مقارنة بالخلايا euploid متساوية التكوين ، مما يدل على انخفاض أربعة أضعاف تقريبا. في المرحلة العصبية المتأخرة ، خرجت معظم الخلايا euploid متساوية الجين من دورة الخلية مع الحد الأدنى من تلطيخ KI67 ، بينما ظلت غالبية خلايا متلازمة داون إيجابية KI67 ، مما يدل على زيادة خمسة أضعاف. أكد زوج ثان من متلازمة سونغ ومتساوي الصيغة الصبغية iPSCs البشرية انخفاض مستويات الخلايا العصبية الإيجابية TUBB3 وارتفاع الخلايا السلفية العصبية الإيجابية PAX6 في ثقافات متلازمة داون في نهاية التمايز العصبي ، مع انخفاض مزدوج في الخلايا العصبية الإيجابية TUBB3 ، وزيادة أكثر من الضعف في الخلايا الإيجابية PAX6.
