نحن نعمل بين أقسام الكيمياء وعلوم الحياة ، ونطور روابط تساهمية تفاعلية جديدة لمجموعة من أهداف الأدوية المضادة للسرطان. من المأمول أن يتم استخدام هذه الجزيئات في المستقبل ، إما كعلاجات أو ربما كمجسات كيميائية. لذلك توجد العديد من التقنيات لفحص الروابط التساهمية.
يمكن تقسيمها على نطاق واسع إلى تقنيات البروتينات حيث يتم احتضان المركبات بخلايا مستنبتة وقياس الطيف الكتلي المستخدم لتحديد البروتينات التي تسميها الجزيئات والطرق القائمة على الهدف حيث يتم احتضان مكتبات المحبة للكهرباء ببروتينات فردية. يتعلق التحدي التجريبي الكبير بتفاعل الروابط التساهمية. غالبا ما تظهر الجزيئات شديدة التفاعل كضربات أثناء فحوصات الفحص ، ولكنها غير مناسبة لأنها ستصنف بشكل غير انتقائي العديد من البروتينات المختلفة في الخلية.
لذلك ، من الأهمية بمكان أن يتم النظر في مركب النشاط في كل خطوة من خطوات اكتشاف الدواء التساهمي. لذلك طورت مجموعتا مان وأرمسترونغ في إمبريال طريقة جديدة لفحص المحبين للكهرباء مقابل هدف بروتيني يسمى الربط الكمي الذي لا رجعة فيه أو اختبار qIT. يوفر بروتوكولنا طريقة جديدة تشتد الحاجة إليها لفحص المحببات الكهربائية مقابل هدف البروتين ، وهو قابل للتطوير ، ولا يتطلب قياس الطيف الكتلي ، وعناصر تحكم في التفاعل الجوهري المركب.
للبدء ، قم بإعداد جميع محاليل المخزون المطلوبة واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين قبل التجربة. الربط الكمي أو الربط الذي لا رجعة فيه أو المخزن المؤقت لفحص qIT مع غاز الأرجون لمدة 30 دقيقة تقريبا. لإجراء تبادل عازل ، قم بتخفيف محلول البروتين بما يزيد عن المخزن المؤقت لمقايسة qIT منزوع الغازات في وحدة مرشح الدوران ، وقم بالدوران عند 4 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية لتركيز البروتين.
ثم قم بتخفيف محلول البروتين المستهدف إلى تركيز 15 ضرسا صغيرا في مخزن فحص qIT منزوع الغازات لتحضير تسعة ملليلتر من المحلول. قم بتوزيع محلول TCEP-agraose ، والمخزن المؤقت qIT ، ومخزون الجلوتاثيون في الآبار المناسبة للألواح المكونة من 384 بئرا. انقل 1.8 ميكرولتر من كل بئر مقابل للوحة مكتبة الأجزاء لإنشاء لوحة تخفيف مركبة تخفف كل مركب إلى 1.5 مللي مولار في المخزن المؤقت لفحص qIT ، بالإضافة إلى 3٪ DMSO.
استخدم محطة سحب العينات 384 لنقل 20 ميكرولترا من المحلول المركب من كل بئر من لوحة التخفيف المركبة إلى كلتا لوحي التفاعل. للبدء ، قم بإعداد الربط الكمي الذي لا رجعة فيه أو اختبار qIT مع البروتين والجلوتاثيون المطلوبين. قم بتوزيع 500 مخزون ميكرومولار لكل ألف دقيقة في 111.2 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وقم بتخزينها عند 20 درجة مئوية.
بعد إذابة مخزون CPM ، أضفه إلى 40 مل من المخزن المؤقت لإخماد مقايسة qIT لتحضير محلول 1.4 ميكرومولار قم بتوزيع 27 ميكرولترا من محلول تبريد CPM في كل بئر من لوحين طازجين سعة 384 بئرا. الطرد المركزي لوحة تفاعل البروتين عند 200 جم لمدة ثلاث دقائق لحبيبات TCEP-agarose. في النقاط الزمنية المحددة مسبقا، استخدم محطة سحب العينات 384 لنقل ثلاثة ميكرولترات من العينة من كل بئر من لوحة تفاعل البروتين إلى لوحة التبريد CPM.
قم بإزالة العينة من أعلى البئر مع تجنب شفط TCEP-agarose في الأسفل. احتضان ألواح إخماد CPM في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، وقم بقياس شدة التألق بإثارة عند 384 نانومتر وانبعاث عند 470 نانومتر. للبدء ، قم بإجراء الربط الكمي الذي لا رجعة فيه أو اختبار qIT بالبروتين المطلوب وإخماد العينات في لوحة CPM.
لكل إخماد ، احسب Z أولي كمقياس لجودة المقايسة. ثم احسب متوسط قيم التألق لآبار التحكم السالبة في العمودين الأول والثاني وآبار التحكم الموجبة في العمودين 23 و 24. قم بتطبيع كل تفاعل جيدا لمتوسط قيم التألق للعناصر الإيجابية والسلبية ، ورسم النسبة المئوية المعدلة مقابل الوقت لكل مركب يتفاعل مع الجلوتاثيون ومع البروتين المستهدف.
باستخدام GraphPad ، قم بتركيب النسبة المئوية المعدلة مقابل بيانات الوقت مع نموذج اضمحلال أسي أحادي الطور لكل من التفاعلات باستخدام المعادلة ، AE إلى قوة KT C. استخدم المعدل الذي تتفاعل به الشظايا مع البروتين والجلوتاثيون لحساب عامل تحسين المعدل أو قيمة REF لكل جزء. أخيرا ، لتحديد أجزاء الضرب ، قم بتعيين عتبة REF ، أو معدل ضرب عشوائي ، أو حدد أجزاء ذات ثلاثة انحرافات معيارية أكبر من المتوسط الهندسي. تفاعل المركب الأول مع بقايا السيستين على البروتين المستهدف بمعدل أكبر بستة أضعاف من الجلوتاثيون ، حيث استوفى معيار النتيجة ل REF أكبر من ثلاثة.
لم يظهر المركب الثاني معدل تفاعل متسارع مع بقايا السيستين المستهدفة مقارنة بالجلوتاثيون ، مما يشير إلى نقص التفاعلات غير التساهمية الإنتاجية ، وبالتالي لم يتم اختياره كضربة.
