على حد علمنا ، هذا البروتوكول هو الأول الذي ينتج مصفوفات منزوعة الخلايا من عضلات الهيكل العظمي الجنينية ، مما يوفر نهجا جديدا لدراسة الاعتلالات العضلية التي تبدأ في التطور في الرحم. يولد هذا البروتوكول مقاييس تنموية ومحددة للأنسجة يمكن استخدامها لدراسة سلوك الخلايا العضلية والتفاعلات مع المصفوفة خارج الخلية في بيئة خاضعة للرقابة. LAMA2-CMD هو ضمور عضلي خلقي يبدأ في الظهور عند الولادة.
يمكن أن يساعد هذا النموذج في كشف آليات النمط المشاركة في بدايته ويؤدي إلى علاجات مستهدفة جديدة. يمكن تكييف هذا البروتوكول مع الأنسجة المختلفة ونماذج الأمراض. يمكن تحقيق مستويات تعقيد مختلفة اعتمادا على أنواع المصفوفة والخلايا ، مما يدل على تنوع النظام.
هذا بروتوكول مباشر للغاية. الجزء الأكثر تحديا هو جمع العينات والتعامل معها. ولكن ، مع الممارسة ، يمكن بسهولة تحسين المهارات التقنية.
ابدأ بنقل جنين واحد تم قتله رحيما في كل مرة إلى طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني مثلج. بعد استئصال الجلد والأطراف ، قطع الجانب البطني من القفص الصدري. إزالة القص والأعضاء الكامنة.
ضع الجانب الظهري للأجنة لأعلى وقم بإزالة الجزء العنقي من العمود الفقري. بعد ذلك ، قم باستئصال رواسب الدهون الظهرية والنسيج الضام لعضلات الظهر العميقة. الآن ، ثبت القفص الصدري باستخدام ملقط جراحي.
باستخدام مشرط دقيق ، اكشط بعناية لفصل عضلات الظهر العميقة عن الأنسجة المحيطة. قم بتخزين الأنسجة في برنامج تلفزيوني في صفيحة زراعة خلايا مكونة من 12 بئرا عند أربع درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل. لفترة أطول ، قم بتخزين الأنسجة في أنبوب طرد مركزي فارغ عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر.
في اليوم الأول ، استخدم كتل العضلات المحورية الكاملة. أضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت منخفض التوتر الذي يحتوي على 1٪ من البنسلين والستربتومايسين إلى كل بئر من صفيحة 12 بئرا. أضف جزءا من الأنسجة العضلية إلى كل بئر واحتضانها طوال الليل لمدة 18 ساعة مع الإثارة.
في اليوم الثاني ، قم بإزالة المخزن المؤقت باستخدام ماصة ذات طرف رفيع. الآن اغسل العينات ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من PBS مع تحريض لمدة ساعة واحدة في كل مرة. بعد التخلص من PBS ، احتضان العينات في ثلاثة ملليلتر من محلول منظف SDS 0.05٪ لمدة 24 ساعة مع الإثارة.
في اليوم الثالث ، استخدم ماصة رفيعة لإزالة منظف SDS وغسل الشظايا ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من محلول الغسيل منخفض التوتر مع تحريط لمدة 20 دقيقة في كل مرة. استبدل محلول الآبار بمليلتر من محلول DNase واحتضان شظايا الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات مع الإثارة. بعد إزالة محلول DNase ، اغسل الشظايا ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من PBS مع تحريض لمدة 20 دقيقة في كل مرة ، مع ترك الغسيل الأخير طوال الليل.
إلى قارورة T-25 المصنفة بخلايا C2C12 دون التقارب ، أضف 500 ميكرولتر من التربسين وأعد تعليقها في ملليلتر واحد من الوسط الكامل. امزج 10 ميكرولتر من التعليق مع 10 ميكرولتر من صبغة تريبان الزرقاء وقم بتحميلها في مقياس الدم لحساب عدد الخلايا وتقدير صلاحيتها. في غطاء التدفق الصفحي ، ضع المصفوفات منزوعة الخلايا ، أو dECMs ، في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني مع 1٪ بنسلين وستربتومايسين.
باستخدام مشرط دقيق وملاقط ، افصل المصفوفات إلى قطع صغيرة. نقل الشظايا إلى آبار صفيحة 96 بئرا ، ووضع ثلاث إلى أربع قطع لكل بئر. أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل المسخن مسبقا في كل بئر واحتضن الطبق لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
تخلص من الوسط في صفيحة البئر وأضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل الذي يحتوي على 50،000 خلية C2C12 قابلة للحياة إلى كل بئر. احتضان لوحة البئر لمدة يومين. انقل dECMs مع الخلايا إلى 48 صفيحة بئر تحتوي على 400 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل.
نضح الوسط بعناية كل يومين لمنع انفصال المصفوفة وتجديده بالوسط الطازج حتى اليوم الثامن. للتمايز، استبدل وسط الاستزراع الكامل بوسط تمايز واحتضانه لمدة أربعة أيام حتى اليوم 12. كانت الأنسجة العضلية حمراء مباشرة بعد العزلة وتحولت إلى اللون الأبيض بسبب تحلل الخلايا بعد الحضانة في المخزن المؤقت منخفض التوتر.
SDS يجعل العضلات تصبح شفافة. بعد معالجة DNase ، تم الحصول على dECM أصغر وشفاف. يكشف القياس الكمي للحمض النووي عن انخفاض بنسبة 100٪ تقريبا في dECMs مقارنة بالأنسجة الأصلية.
أظهرت dECMs والأنسجة الأصلية تلطيخا أنبوبيا مشابها للامينين ألفا اثنين وبروتين اللامينين. أظهر تحليل اللطخة الغربية للأنسجة الأصلية شريطين للوحدة الفرعية laminin alpha two ، بينما تم اكتشاف ثلاثة نطاقات أصغر في dECM. بالنسبة لللامينين الكلي ، أظهرت عينات dECM تجزئة البروتين عند مقارنتها بالأنسجة الأصلية.
كان الفبرونيكتين والكولاجين I موجودين في الفراغ الخلالي بين خلايا الأنسجة الأصلية و dECMs. كانت عصابات الفبرونيكتين مماثلة موجودة في كلتا العينتين ، مما يشير إلى أنها لا تتأثر بإزالة الخلايا. لوحظ عدد أقل من نطاقات الكولاجين I في dECMs.
بالنسبة للكولاجين الوريدي ، أظهرت كلتا العينتين تلطيخا أنبوبيا مشابها. ومع ذلك ، كان الوزن الجزيئي لنطاقات dECM أقل. استعمرت خلايا C2C12 وتكاثرت في dECMs واندمجت في أنابيب عضلية متعددة النوى.
عبرت هذه عن بروتين سلسلة الميوسين الثقيل بعد أربعة أيام من الحضانة في وسط التمايز. لوحظ تلطيخ داخل الخلايا وحول الخلية لسلسلة اللامينين ألفا الثانية ، واللامينين الكلي ، والفبرونيكتين. يمكن استخدام سقالات الهيكل العظمي للفأر الجنيني المنزوع الخلايا لنمو الخلايا في أنظمة الاستزراع المشترك ، مما يجعلها أقرب إلى الوضع في الجسم الحي ، وبالتالي تساهم في فهم أمراض العضلات.
