يمكن لهذه التقنية تحديد النمط الوراثي S بكفاءة وتحديد عدم التوافق الذاتي للحمضيات بدقة ، مما يوفر المعلومات اللازمة لاختيار أشجار الملقحات المناسبة. هذه تقنية فعالة من حيث الوقت وبسيطة وموثوقة لاختيار أشجار الوالدين المناسبة في برامج التربية. هذه التقنية بسيطة وسهلة القيام بها والقيام بالتجربة لأول مرة يحتاج إلى الصبر والرعاية.
يحتاج تحديد النمط الجيني S وتصميم التمهيدي الخاص ب S إلى مزيد من الاهتمام والرعاية. سيكون يو هو ، طالب دراسات عليا من مختبري ، يوضح الإجراء الخاص بي. ابدأ جمع حبوب اللقاح عن طريق أخذ زهور ماجيا بوميلو ، الحمضيات القصوى ، إلى المختبر.
اجمع الأنثرات باستخدام الملقط وضعها في طبق بتري يحتوي على ورق ترشيح. جفف حبوب اللقاح عن طريق وضع طبق بتري الذي يحتوي على الأنثرات في فرن 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد التجفيف ، احفظ حبوب اللقاح في كيس قفل بسحاب محكم الإغلاق من Micro Centron يحتوي على هلام السيليكا المتغير اللون.
أغلق الكيس وقم بتسمية الكيس باسم صنف حبوب اللقاح وتاريخ التخزين. صب 300 ميكرولتر من الوسط السائل في غطاء أنبوب طرد مركزي سعة 2 مليلتر ورش حبوب اللقاح بالتساوي بمساعدة فرشاة التلقيح. ضع حبوب اللقاح في صندوق أسود مرطب واحتضانها عند 28 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
بعد الحضانة ، قم بقطع الطرف العلوي الذي يبلغ طوله ملليمترا واحدا من طرف ماصة سعة 1،000 ميكرولتر واستنشق حبوب اللقاح بكمية صغيرة من محلول الثقافة. ضع حبوب اللقاح في وسط شريحة المجهر وقم بتغطيتها بقسيمة غطاء. بمجرد الانتهاء من ذلك ، راقب العينة باستخدام مجهر مقلوب باستخدام هدف 10X.
قم بإجراء ثلاث نسخ متماثلة مستقلة باستخدام نفس كثافة حبوب اللقاح تقريبا لكل نسخة متماثلة. للتلقيح ، استخدم فرشاة التلقيح لنشر كمية كافية من حبوب اللقاح القابلة للحياة على سطح وصمة العار ، مع ضمان عدم إتلاف المدقة. قم بتغطية الزهور الملقحة بكيس ورقي من الكبريتات ومنع التلقيح عن طريق حبوب اللقاح المميزة وراثيا عن طريق إغلاق الكيس باستخدام مشبك ورق.
اكتب اسم النوع وعدد ووقت التلقيح على الملصق. الملصق على الفروع القريبة من الزهور الملقحة. قم بإزالة أكياس التلقيح بعد حوالي ثلاثة إلى أربعة أيام من التلقيح واجمع الزهور الملقحة في أكياس بسحاب.
قم بإزالة البتلات والأوعية والمبيضين على الفور من الزهور واغمر وصمة العار المنصهرة في أنبوب طرد مركزي يحتوي على محلول مثبت طازج. احتضان وصمة العار والأناقة في محلول التثبيت طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، تخلص من المحلول المثبت قبل غسل وصمة العار وقم بتصفيف مرتين إلى ثلاث مرات في 95٪ إيثانول.
بعد ذلك ، أضف 70٪ من محلول الإيثانول إلى النمط ، مما يضمن غمر العينة تماما في المحلول. يمكن تخزين الأنماط في هذه المرحلة عند أربع درجات مئوية لمدة شهر إلى شهرين. لتلطيخ الأنيلين الأزرق ، اغسل عينات النمط المخزنة في 70٪ إيثانول بالماء المقطر ثلاث إلى أربع مرات.
اغمسه في محلول هيدروكسيد الصوديوم رباعي الموليات وأغلقه قبل احتضانه في حمام مائي بدرجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. خلال هذه الخطوة ، يتغير لون النمط من الأصفر والأبيض إلى البرتقالي والأحمر. بعد ذلك ، نقع الأنماط في الماء المقطر.
بعد 30 دقيقة ، تخلص من الماء المقطر واغسل الأنماط بالماء المقطر ثلاث إلى أربع مرات أو حتى يصبح لون النمط أصفر. ثم أضيفي الأنيلين الأزرق حتى تغمر العينة واحتضنها لمدة 12 ساعة في الظلام. راقب نمو أنبوب حبوب اللقاح تحت المجهر الفلوري.
ضع الشريحة على طاولة مسطحة. قسم النمط إلى نصفين على طول المحور الطولي باستخدام مشرط. ضع نصف النمط على شريحة زجاجية وأضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من البولي إيثيلين جلايكول إلى سطح الشريحة.
ثم قم بتغطيته بقسيمة غطاء. بمجرد الانتهاء من ذلك ، ضع الشريحة على مرحلة المجهر فوق الفتحة وتصور باستخدام هدف 10X. استخدم مرشح DAPI ولاحظ نمو أنبوب حبوب اللقاح.
لاحظ خمسة أنماط لكل نوع من أنواع التلقيح. تم قياس صلاحية حبوب اللقاح للحمضيات القصوى ومعدلات الإنبات باستخدام المجهر الفلوري. نجحت حبوب اللقاح المتوافقة في الإنبات على سطح وصمة العار وأنتجت أنبوب حبوب اللقاح الطبيعي ، والذي نما وأدى في النهاية إلى الإخصاب في المبيض.
في المقابل ، نمت أنابيب حبوب اللقاح غير المتوافقة من خلال ما يقرب من 2/3 من النمط ثم توقفت عن النمو. اكتشف الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز منتج الحمض النووي المضخم باستخدام الاشعال الخاصة بموضع S. أظهر تضخيم ناتج الحمض النووي بين 500 إلى 1،000 زوج من القواعد.
تم تحديد النمط الجيني S المقابل. تم تحديد أنماط فردانية 21 S في أنواع مختلفة من الحمضيات باستخدام هذه الطريقة. خطوة التلقيح أمر بالغ الأهمية.
فقط التلقيح الناجح يمكن أن يضمن الملاحظة اللاحقة لأنابيب حبوب اللقاح. تم استخدام هذه التقنية لتحليل سمات عدم التوافق الذاتي واستكشاف وتحديد المحددات الأنثوية لعدم التوافق الذاتي. هذه الطريقة مهمة لبرامج البحث والتربية غير المتوافقة مع الذات.
كما يمكن أن يسهل على المجتمع الزراعي اختيار أشجار الملقحات لبساتينهم.
