حمض الهيالورونيك هو واحد من أكثر المصفوفة خارج الخلية وفرة في النموذج الحيواني. تم إثبات أهمية حمض الهيالورونيك في التطور الجنيني. هذا النموذج في المختبر مفيد لاستكشاف كيفية التصاق خلايا القمة العصبية وهجرتها داخل المصفوفة خارج الخلية الغنية بحمض الهيالورونيك.
باستخدام تقنيتنا ، يمكننا تقييم الهجرة وقدرة تدهور HA لكل من السكان بالجملة ثم الخلايا الفردية بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية لفحص الأدوية للعثور على مركب يسرع أو يمنع تدهور حمض الهيالورونيك. للبدء ، قم بتخفيف مصفوفة الغشاء القاعدي باستخدام PBS المبرد بنسبة 1:50 واحتفظ بها على الجليد.
قم بتغطية صفيحة ثقافة 10 سم ب 10 ملليلتر من محلول المصفوفة المخفف واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. اغسل الطبق ثلاث مرات بمليلتر من برنامج تلفزيوني. لزراعة الخلايا O9-1 على الصفيحة المطلية بالمصفوفة ، قم بتسخين الجذع الجنيني الكامل أو وسط الخلايا الجذعية الجنينية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
امزج تعليق الخلية O9-1 برفق واحسب عدد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي. ثم اضبط تركيز الخلية على 1.1 مليون خلية لكل مليلتر باستخدام وسيط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل. أضف ثمانية ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل المسخن مسبقا إلى صفيحة الاستزراع المطلية بالمصفوفة التي يبلغ طولها 10 سم وبذر خلايا O9-1 بمعدل 1.1 مليون خلية لكل لوحة.
احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. في اليوم التالي ، استبدل الوسط بوسط خلية ES كامل جديد مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. استبدله بوسط طازج كل يومين إلى ثلاثة أيام بعد ذلك.
اغسل طبق الاستزراع بمليلتر من PBS ثم أضف ملليلتر من 0.25٪ Trypsin-EDTA المسخن مسبقا. احتضان لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. أضف ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل المسخن مسبقا إلى لوحة الاستزراع وانقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
قم بطرد الأنبوب عند 300 جرام لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. أضف ملليلتر من وسيط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل المسخن مسبقا إلى الأنبوب وأعد تعليق الخلايا تماما عن طريق الماصة. ثم قم بزرع الخلايا على طبق استزراع جديد بكثافة الخلية المطلوبة.
أضف بعناية 50 ميكرولترا من ثلاثي إيثوكسيسيلان غير المخفف إلى طبق سفلي زجاجي 3.5 سم واحتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. اغسل الطبق ثلاث مرات بمليلتر من الماء المقطر وأضف 50 ميكرولتر من 0.25٪ جلوتارالدهيد مخفف 100 مرة في برنامج تلفزيوني لكل طبق. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ثم اغسل أربع مرات مع ملليلتر من برنامج تلفزيوني وتغطي الأطباق مع 300 ميكرولتر من الكولاجين نوع واحد في 0.2 حمض الخليك العادي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
مرة أخرى ، اغسل ثلاث مرات مع ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أضف 300 ميكرولتر من 200 ميكروغرام لكل مليلتر فلورسينامين ، المسمى هيالورونات الصوديوم H2 إلى كل طبق واحتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. اغسل مرة أخرى مع ملليلتر من PBS ثلاث مرات.
بعد تجفيف الطبق السفلي الزجاجي المطلي ، قم بتوصيل إدراجين لثقافة البئر بالأطباق واملأ الإدخالات خارجيا بمليلتر واحد من PBS. قم بزرع خلايا O9-1 في الآبار عند 10،000 خلية في 100 ميكرولتر من DMEM تحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني أو FBS لكل إدخال. قم بزراعة الخلايا لمدة يومين عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ ، والتقط صورا متباينة للمرحلة كنقطة زمنية للبدء ، باستخدام مجهر مضان الكل في واحد.
قم بإزالة الحشوات بعناية من الأطباق السفلية الزجاجية المطلية بملاقط واغسل الأطباق السفلية الزجاجية المطلية برفق باستخدام ملليلتر من PBS لإزالة الخلايا وحطام الخلايا. أضف ملليلتر من DMEM الطازج الذي يحتوي على 2٪ FBS إلى الأطباق المستزرعة. قم بزراعة الخلايا لمدة 48 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون والتقاط صور تباين الطور بعد 24 ساعة و 48 ساعة في الثقافة.
اغسل الأطباق باستخدام برنامج تلفزيوني وقم بإصلاح الخلايا بعد 48 ساعة باستخدام ملليلتر واحد من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الأطباق ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني طازج. أخيرا ، ضع زلة غطاء مع وسيط التثبيت لمزيد من المراقبة المورفولوجية.
يظهر في هذا الشكل المقاطع المستعرضة للأنبوب العصبي لأجنة علم Tmem2 عند E9.0. تم تسمية الأقسام الموجودة على مستوى الجمجمة والجذع للأنبوب العصبي بعلامة مزدوجة لبروتين علم Tmem2 والهيالورونان. لوحظ تعبير Tmem2 في الصفيحة العصبية والمنطقة الحدودية للأنبوب العصبي بينما كانت هذه المواقع خالية من تلطيخ الهيالورونان.
يتم عرض العلامات المزدوجة لخلايا القمة العصبية لعلم Tmem2 و Sox9 هنا. تم تلطيخ المقاطع المستعرضة للأنبوب العصبي E9.0 لعلم Tmem2 و Sox9. يوضح هذا الشكل الصور التمثيلية لخلايا Tmem2 المستنفدة وخلايا التحكم O9-1 المستزرعة على طبق استزراع عادي.
تم تقييم تعبير Tmem2 في هذه الخلايا بواسطة qPCR مع GAPDH كعنصر تحكم داخلي للتطبيع. تم استزراع خلايا Tmem2 المستنفدة والسيطرة O9-1 لمدة 48 ساعة على زلات غطاء زجاجي مطلية بالهيالورونان المفلور. تم الكشف عن نشاط الهيالورونان المهين كمناطق مظلمة في الخلفية الفلورية.
كما تمت مقارنة مستوى تحلل الهيالورونان كميا بين خلايا Tmem2 المستنفدة وخلايا التحكم O9-1. يظهر في هذا الشكل تدهور الهيالورونان المرتبط بالركيزة عند الالتصاقات البؤرية في خلايا O9-1. كانت خلايا O9-1 المزروعة على ركائز مختلطة تتكون من Col1 / HA موسومة بجسم مضاد للفينكولين.
تمثل البقع أو الخطوط الداكنة نشاط تحلل الهيالورونان في ركيزة FAHA H2. تم تحديد مواقع تحلل الهيالورونان والالتصاقات البؤرية على الركائز المختلطة. يعد طلاء كوفال للأطباق ذات القاع الزجاجي ب HA خطوة حاسمة في البروتوكول لأن الطلاء غير الكافي يمكن أن يؤدي إلى إزالة HA بسهولة عن طريق القوة الميكانيكية أثناء الالتصاق والهجرة.
لضمان الطلاء المناسب ، نستخدم الجلوتارالدهيد ، الكولاجين من النوع الأول المتجمد كيميائيا على الزجاج عن طريق اقتران التسليح بالألدهيد. من الممكن استخدام ركيزة مصفوفة خارج الخلية بجانب الكولاجين من النوع الأول ، ولكن يجب أن تحتوي على مجموعات تسليح وقد تكون هناك قيود في طلائها على أطباق القاع الزجاجي بسبب خصائصها الكيميائية. لذلك قد تكون التجربة والخطأ ضرورية لتحديد أفضل نهج.
يمكن أن تكون هذه التجربة المعملية مفيدة في دراسة كيفية عمل جزيء معين أثناء حركة خلايا القمة العصبية في بيئة HA أو HA حول الأنبوب العصبي. يمكن أن يكون أيضا وسيلة مفيدة لاختبار الدواء الذي يمكن أن يسرع أو يمنع عملية الهجرة هذه. من المثير للاهتمام معرفة سبب امتلاك Tmem2 لوظائف الالتصاق على HA وتدهور HA ولماذا يجب تحلل HA في موقع التماسك الكامل.
نظرا لأن HA هو المادة الأكثر شيوعا في المصفوفة خارج الخلية ، فإن معرفة إجابة هذا السؤال أمر مهم حقا في علم الأحياء والطب. هذا البروتوكول التجريبي ذو قيمة لأنه يمكن تطبيقه على أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الليفية الجلدية والخلايا الظهارية والخلايا السرطانية.
