على عكس المسارات الأيضية الأخرى مثل التخلص من الجلوكوز ، لا يتم تقييم تخليق الأحماض الدهنية بشكل روتيني ، مما يؤدي إلى تفسيرات غير كاملة لحالة التمثيل الغذائي. تتمثل الفوائد الرئيسية لهذه الطريقة في أنها غير جراحية نسبيا ، ومن المحتمل أن تكون انعكاسا أفضل لتدفق تخليق الأحماض الدهنية من استخدام الجلوكوز المسمى بالنظائر حيث يمكن أن تؤثر التغييرات في معالجة الجلوكوز في المنبع على النتائج. هنا ، نركز على الأنسجة الدهنية البنية ، ولكن هذه الطريقة قد تكون مفيدة لدراسة أي نسيج في أي نموذج فأر.
للبدء ، ضع العينات على الثلج الجاف. خذ أنبوب طرد مركزي دقيق المسمى مسبقا ، وضعه على ميزان تحليلي وكشف الميزان. ثم ضع ملاقط ومشرط أو شفرة حلاقة فولاذية على الثلج الجاف لمدة 10 إلى 20 ثانية لتبرد.
استخدم الملقط لإخراج عينة الأنسجة المجمدة من الأنبوب ووضعها على قارب وزن بلاستيكي ، والذي يمكن وضعه على كتلة مسطحة من الثلج الجاف أو سطح آخر مبرد مسبقا. باستخدام المشرط أو شفرة الحلاقة الفولاذية ، قم بتشريح جزء صغير من الأنسجة يعادل وزن 5 إلى 15 ملليغرام ، وضعه في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. سجل الوزن الدقيق وكرر لكل عينة.
أضف ميكرولتر واحد لكل ملليغرام من حمض D31 سداسي الملي مولار ، متبوعا بثلاث حبات من الفولاذ المقاوم للصدأ خمسة ملليمترات لكل عينة. ثم أضف 250 ميكرولترا من الميثانول و 250 ميكرولترا من الماء و 500 ميكرولترا من الكلوروفورم إلى كل عينة بها خرز. ضع الأنابيب في كتلة مبردة مسبقا من مطحنة الطحن واخلط العينات بتردد اهتزازي يبلغ 25 هرتز لمدة خمس دقائق.
قم بإزالة الخرزات باستخدام مغناطيس وأجهزة طرد مركزي للعينات عند 12،000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. باستخدام ماصة صغيرة ، خذ حجما ثابتا من المرحلة السفلية لكل عينة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات العلامات المقابلة. أضف 500 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى العينة المتبقية وكرر هذه الخطوات.
ضع الأنابيب مع المرحلة السفلية المدمجة تحت غاز النيتروجين أو في فراغ طرد مركزي مبرد مقاوم للكلوروفورم عند أربع درجات مئوية حتى يجف تماما. ماصة 98 ملليلتر من الميثانول اللامائي في زجاجة وسائط زجاجية. وأضف ببطء ملليلتر من حمض الكبريتيك اللامائي في غطاء الدخان لإنتاج 2٪ حمض الكبريتيك في الميثانول.
تخلط عن طريق تحريك الزجاجة المغلقة. أضف 500 ميكرولتر من حمض الكبريتيك 2٪ في محلول الميثانول لكل عينة ودوامة لفترة وجيزة. احتضان العينات على الكتلة الحرارية عند 50 درجة مئوية لمدة ساعتين وإضافة 100 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم المشبع و 500 ميكرولتر من الهكسان لكل عينة.
دوامة العينات بقوة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة وترك العينات للجلوس لمدة دقيقة واحدة. يجب أن تكون المرحلتان واضحتين بعد ذلك. اجمع المرحلة العليا في أنبوب طرد مركزي جديد.
ثم كرر إضافة الهكسان. وبعد فصل الطور ، اجمع عينات المرحلة العليا الثانية في نفس الأنابيب الموسومة. جفف العينات في درجة حرارة الغرفة تحت غاز النيتروجين وأعد تعليق العينات في 20 ميكرولترا من الهكسان لكل ملليغرام من وزن الأنسجة الأصلي.
انقل العينات على الفور إلى قارورة كروماتوغرافيا غاز زجاجية مع ملحق زجاجي. حقن العينات في مطياف كتلة كروماتوغرافيا غاز رباعي واحد لتحديد وفرة استرات ميثيل الأحماض الدهنية أو نظائر FAMEs. أدخل ميكرولترا واحدا من العينة في مدخل مقسم أو غير مقسم عند درجة حرارة مدخل 270 درجة سلزية باستخدام الهليوم كغاز حامل.
في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات القفل الآمن ، اجمع بين 10 ميكرولتر من كل عينة بلازما أو أربعة ميكرولترات قياسية من 10 هيدروكسيد الصوديوم المولي وأربعة ميكرولتر من الأسيتون 5٪ في الأسيتونيتريل. نفذ ذلك في ثلاث نسخ لكل عينة. بعد احتضان العينات طوال الليل في درجة حرارة الغرفة ، أضف 450 إلى 550 ملليغرام من كبريتات الصوديوم إلى كل عينة ، وأضف 600 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل أنبوب في غطاء الدخان ، ودوامة قوية لمدة 15 ثانية.
أجهزة الطرد المركزي العينات في 300 غرام لمدة دقيقتين. خذ قوارير GCMS الزجاجية ذات العلامات مع إدخالات زجاجية وانقل ثلاث نسخ ثم 80 ميكرولتر من المادة الطافية من كل عينة إلى القنينات. قم بتغطية القوارير بإحكام لتحليل GCMS.
النسبة المئوية لتخصيب D2O في بلازما الفئران خلال نقاط زمنية متعددة موضحة هنا. وقد وجد أن مياه الجسم غنية في حدود 2.5 إلى 6 ٪ أن مستوى خط الأساس لتخصيب الديوتيريوم في مياه الجسم يتم تحقيقه بسرعة في ساعة واحدة والحفاظ عليه طوال مدة الدراسة. يظهر هنا التوزيع النظائري الشامل للبالميتات في الأنسجة الدهنية البنية بعد ثلاثة أيام من إعطاء D2O في درجة حرارة الغرفة والحياد الحراري.
تظهر هذه النتيجة إثراء أعلى للديوتيريوم M1 و M2 في درجة حرارة الغرفة. يتم عرض إثراء ضرس الأنسجة الدهنية البنية وإثراء البلازما لمجموعة من الأحماض الدهنية بعد ثلاثة أيام من إعطاء D2O في درجة حرارة الغرفة والحياد الحراري في هذا الشكل. تم العثور على تخصيب درجة الحرارة الباردة في مجموعة واسعة من الأحماض الدهنية في الأنسجة الدهنية البنية.
والجدير بالذكر أن إثراء الأحماض الدهنية الكلي في البلازما لا يتبع نفس اتجاه الأنسجة الدهنية البنية ، ولكن بدلا من ذلك ، يتم زيادة إثراء الأحماض الدهنية مع الحياد الحراري. تمثل هذه الصور الوفرة الكلية والبالميتات التي تم تصنيعها من دي نوفو في الأنسجة الدهنية البنية بعد ثلاثة أيام من إعطاء D2O. تظهر النتيجة زيادة في تخليق بالميتات الكلي في درجة حرارة الغرفة.
كن حذرا عند تشغيل الأحماض الدهنية على GCMS. تأكد من عدم تحميل بالميتات بشكل زائد لأنه يمكن أن يعطي قيم تخصيب نظائر عالية بشكل مصطنع. بالإضافة إلى ذلك ، عند تحليل الأسيتون على GCMS ، تأكد من عدم وجود ذروة الأسيتون في الخلفية قبل تشغيل العينات ، لذا قم بتشغيل الفراغات لإزالة أي أسيتون في النظام.
تتناول هذه الطريقة إجمالي الأحماض الدهنية عبر فئات متعددة من الليبيدات، ولكن إذا كنت تريد أن تفهم كيف يؤثر تخليق الأحماض الدهنية على فئات معينة من الليبيدات، فيمكنك أولا فصل هذه الفئات من الليبيدات باستخدام الكروماتوغرافيا ثم استخراج الأحماض الدهنية من هذه الكسور. نظرا لأن تكوين الدهون هو مساهم رئيسي في التطور الطبيعي ، ولكن أيضا في العديد من الأمراض ، يمكن أن يكون هذا البروتوكول مفيدا في العديد من المجالات.
