تساعد بروتوكولاتنا على إنشاء فئران معدلة وراثيا تتطلب تجارب متقدمة على الفئران في الجسم الحي ، مثل تصور التعبير الجيني ، والأنسنة الجينية ، والضربة القاضية الجينية الشرطية. تتيح تقنية تحرير جينوم زيجوت الفأر المعروضة هنا تحريضا عالي الكفاءة وسريعا وبسيطا للتعديلات الجينية المتقدمة ، مثل ضربة قاضية لكاسيت الجينات و flox. نظرا لاستخدام الفئران المعدلة وراثيا في مجالات بحثية متنوعة مثل علم الأعصاب والمناعة والتمثيل الغذائي والتكاثر والأمراض المعدية ، فإن تقنيتنا المقدمة هنا تدعم بشكل أساسي هذا المجال البحثي الواسع.
سيوضح الإجراء ناتسومي إيكي وميوكي إيشيدا ويوكو تانيموتو ، الموظفون الفنيون من مختبري. للبدء ، قم بإعداد طبقين بتري 35 ملم لثقافة الزيجوت ووضعهما في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى الاستخدام. اجمع قنوات البيض وضعها في قطرة 20 ميكرولتر من وسط M2 تحتوي على 0.75 ملليغرام لكل ملليلتر من الهيالورونيداز على غطاء طبق بتري.
استخدم ملقط طرف رفيع لالتقاط قناة بيض واحدة ولف حوالي 50 ميكرولترا من وسط M2 مع الهيالورونيداز من خلال fimbriae. بعد 30 ثانية ، باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية ، التقط الزيجوت الطبيعي شكليا بكمية صغيرة من الوسط واغسلها عن طريق نقلها إلى قطرات متوسطة M16 جديدة. بعد ذلك ، قم بتجميع الزيجوت المغسول في طبق بتري وكرر العملية حتى يتم استرداد جميع الزيجوتات.
باستخدام مجتذب ماصة قابل للبرمجة ، اسحب بعض الماصات الزجاجية. اكسر طرف إبرة الحقن المجهري عن طريق ضرب الكرة الزجاجية المتصلة بطرف microforge. تحقق من حجم الطرف تحت المجهر عند التكبير 1،000x وتأكد من أن حجم طرف إبرة الحقن المجهري يبلغ قطره حوالي ميكرومتر واحد.
استخدم microforge لثني إبرة الحقن المجهري عند حوالي ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات من الطرف. قم بحقن 1 إلى 1.5 سم من سائل التشغيل في وسط إبرة الحقن المجهري وإرفاقه بحامل الحاقن الدقيق اليدوي باستخدام مشغل بيزو. بعد ذلك ، قم بتوصيل إبرة التثبيت بحامل الحاقن الدقيق اليدوي المقابل وانقل سائل العملية إلى طرف إبرة الحقن المجهري بضغط تدريجي.
إصلاح حوامل الحاقن الدقيق اليدوي على micromanipulator. تحضير غرفة الحقن مع ثلاث قطرات. أولا ، مع 10 ميكرولتر من وسط M2 ، وثانيا ، مع خمسة ميكرولتر من 12٪ بولي فينيل بيروليدون في وسط M2 ، وثالثا ، مع خليط خمسة ميكرولتر من crRNA ، tracrRNA ، بروتين Cas9 ، ومحلول الحمض النووي المانح.
قم بتغطية القطرات بالزيت المعدني واضبط غرفة الحقن على مرحلة المجهر المقلوب. تحت المجهر المقلوب عند تكبير 50x ، قم بخفض ماصة الحقن المجهري إلى انخفاض 12٪ PVP. نضح واستغناء 12٪ PVP لتنظيف الجزء الداخلي من طرف إبرة الحقن المجهري ونقله إلى قطرة RNPD.
ضع الحاقن الدقيق اليدوي تحت ضغط سلبي. قم بامتصاص محلول RNPD في إبرة الحقن المجهري وانتظر حتى يتم استنشاق حجم كاف. تحت تكبير 50x ، املأ الجزء الداخلي بالكامل من إبرة الحقن المجهري بالسائل.
بعد ذلك ، أوقف المدخول واترك محلول RNPD يتم طرده تدريجيا عن طريق ضبط الحاقن الدقيق اليدوي على الضغط الإيجابي. حرك طرف إبرة الحقن المجهري في الزيت. ضع 50 زيجوت في قطرة M2 واخفض ماصة التثبيت برفق في نفس القطرة.
انقل إبرة الحقن المجهري إلى قطرة M2 التي تحتوي على الزيجوت. قم بالتبديل إلى هدف 20x وركز على طرف ماصة الحقن المجهري. بعد الإمساك بزيجوت ، ركز على النواة عن طريق تحريك المعالج الدقيق.
أدخل إبرة الحقن المجهري في الزيجوت واجعل الطرف قريبا من النواة. بمجرد وصول الطرف إلى غشاء النواة ، ضع نبضة بيزو على الثقب. عندما تثقب إبرة الحقن المجهري النواة ، قم بحقن محلول RNPD ولاحظ تورم النواة.
بمجرد نفخ النواة بالكامل ، اسحب الإبرة بسرعة وقم بإجراء نفس الإجراء على كل من النواة الأنثوية والذكورية. قم بتفريق الزيجوت قبل الحقن وبعده عن طريق نقل الزيجوت المحقون إلى مكان آخر داخل قطرة M2 ، واستمر في حقن جميع الزيجوت الموجودة في قطرة M2. بعد الحقن ، انقل الزيجوت إلى طبق M16 طازج.
حدد الزيجوت الذي نجا بعد 10 دقائق من الحقن. قم بإزالة الزيجوت المحللة التي تضررت من الحقن ووزع الزيجوت الباقي على كل قطرة في طبق M16. ضع كمية صغيرة من وسط الاستزراع ، وبعض فقاعات الهواء كعلامة ، والزيجوت في ماصة لنقلها.
باستخدام القص الدقيق ، قم بعمل شق بين الأمبولة و fimbriae من قناة البيض. أدخل الزيجوت في الشق وتأكد في نفس الوقت من إدخال فقاعة الهواء. كان متوسط كفاءة الإنتاج ل 13 فأرا مستقلا في كاسيت الجينات 20.8٪ بحد أقصى 39.5٪ وبحد أدنى 7.9٪ كان متوسط معدل المواليد في ظل حالة استهداف الجينات غير القاتلة هذه 34.0٪ بحد أقصى 43.3٪ وبحد أدنى 15.9٪كان متوسط كفاءة الإنتاج ل 10 فئران متخبطة مستقلة 7.7٪ بحد أقصى 20.7٪ وبحد أدنى 2.1٪ على الرغم من أن وظائف العديد من الجينات المستهدفة كانت غير معروف ، كان متوسط معدل المواليد 30.2٪ بحد أقصى 43.8٪ وبحد أدنى 17.3٪يجب ألا يكون قطر طرف إبرة الحقن رقيقا جدا ، ويجب تعديل ضغط الحاقن اليدوي لضمان حقن المحلول في الإبرة ونفخ النواة ببطء.
