يصف هذا البروتوكول كيفية اختيار أبتامير الحمض النووي التي يمكنها التمييز بين الفيروسات المعدية والفيروسات غير المعدية من أجل الحصول على جزيء استشعار قادر على إبلاغ قابلية العدوى للعينات السريرية أو البيئية. يمكن تطبيق هذه التقنية للحصول على أبتامير انتقائي للعديد من الفيروسات الأخرى ، بما في ذلك الفيروسات الناشئة ، لأنها لا تتطلب معرفة مسبقة بهياكل الفيروس أو تسلسله. تسمح هذه التقنية بتطوير مستشعرات أبتامر للتشخيص السريري والمراقبة البيئية للفيروسات المعدية لاكتشاف ما إذا كان شخص ما معديا أو إذا كانت طريقة التطهير البيئي تعمل على النحو المنشود.
يمكن أن يكون الاختيار عملية صعبة ، خاصة بالنسبة لأولئك الجدد عليها. من المهم تحسين ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل ومراقبة تقدم الاختيار باستخدام qPCR. سيوضح الإجراء ماركوس جراماجو ، طالب دراسات عليا من مختبري.
للبدء ، قم بتصميم مكتبة وبادئات أولية مفردة تقطعت بهم السبل أو SS-DNA. الحصول على oligos الحمض النووي من مصادر تجارية مع تنقية تحلية قياسية. تنقية مكتبة SS-DNA والاشعال على 10 ٪ تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد الكهربائي تليها ترسيب الإيثانول.
بعد ذلك ، احصل على محلول مخزون من الفيروسات المعدية وغير المعدية أو قم بإعدادها كما هو موضح في مخطوطة النص. لتمسخ مكتبة SS-DNA ، امزج 10 ميكرولتر من مكتبة SS-DNA 100 ميكرومولار مع 240 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX. سخني الخليط على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حمام جاف ، ثم ضع الأنبوب على الثلج لمدة 15 دقيقة.
امزج 250 ميكرولترا من مكتبة SS-DNA في مخزن SELEX المؤقت مع 50 ميكرولترا من الفيروسات المعدية للاختيار الإيجابي. احتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 400 ميكرولتر من تسلسل T20 الملي واحد إلى مرشح 0.5 ملليلتر لمنع المواقع غير المحددة.
احتضان المرشحات لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي مرشح في 14،000 غرام لمدة 10 دقائق لإزالة حل T20. ثم اغسل الفلتر ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت SELEX لإزالة تسلسلات T20 الزائدة.
بعد ذلك ، أضف خليط الفيروسات المعدية في مكتبة SS-DNA إلى مرشح 100 كيلودالتون المحظور وأجهزة الطرد المركزي لغسل التسلسلات غير المنضمة. اغسل الفلتر ثلاث مرات بإضافة 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX والطرد المركزي. احتفظ بالكسر في الفلتر وتجاهل التدفق.
لإلغاء التسلسلات المرتبطة ، قم بتغيير أنبوب التجميع لمرشح الطرد المركزي وأضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX الذي يحتوي على ثمانية اليوريا المولية إلى الفلتر. سخني الفلتر عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم استخدم جهاز طرد مركزي لجمع التدفق الذي يحتوي على التسلسلات المستخلصة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، اغسل المواد باستخدام 10٪ مبيض.
بعد ذلك ، أضف محلول الفيروس المعدي SS-DNA الذي تم جمعه في الخطوة السابقة إلى مرشح 10 كيلودالتون المحظور ، وأجهزة الطرد المركزي عند 14،000 جم لمدة 15 دقيقة وتجاهل التدفق. اغسل الفلتر ثلاث مرات ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX لإزالة اليوريا عن طريق الطرد المركزي وتجاهل التدفق. استرجع المحلول في المرشح عن طريق قلبه رأسا على عقب في أنبوب تجميع نظيف والطرد المركزي لمدة خمس دقائق.
قم بقياس الحجم النهائي للمحلول المستعاد باستخدام ماصة وقم بتسميته كعينة مستديرة 1A. خذ 90٪ من عينة الجولة 1A كقالب في الجولة الأولى وقم بتشغيل PCR باستخدام ظروف محسنة. لاستعادة SS-DNA باستخدام حبات مغناطيسية معدلة من الستربتافيدين أو MB ، قم بتقسيم المنتج إلى 50 ميكرولتر من القسامات وإضافتها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 50 ميكرولتر MB. احتضان الأنبوب لمدة 30 دقيقة مع تحريض خفيف في درجة حرارة الغرفة.
ثم ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي لعزل MB وإزالة المادة الطافية عن طريق الماصة. اغسل MB مرتين بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط والغسيل إلى الأنبوب. ثم قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي واضغط عليه قبل إعادة تعليق MB إلى محلول متجانس عن طريق الماصة.
ضع الأنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق MB في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX وقم بتسخين المحلول عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ضع الأنبوب على الفور في الرف المغناطيسي واجمع المادة الطافية التي تحتوي على تجمع SS-DNA.
كرر خطوة الاسترداد هذه بإضافة 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت SELEX. قم بقياس الحجم النهائي للكسر المسترد وقم بتسميته على أنه Round 1X. لتمسخ تجمع SS-DNA ، خذ 60٪ من عينة Round 1X واخلطها مع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX.
سخني العينة في حمام جاف ، ثم ضع الأنبوب على الثلج لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، امزج تجمع SS-DNA المشوه في المخزن المؤقت SELEX مع 50 ميكرولترا من كل فيروس كخطوة اختيار مضادة واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد حظر المواقع غير المحددة في مرشحات أجهزة الطرد المركزي ، أضف الخليط المشوه SS-DNA المجمع المحتضن بمحلول فيروس إلى مرشح 100 كيلودالتون المحظور.
أجهزة الطرد المركزي مرشح في 14،000 غرام لمدة 10 دقائق وجمع التدفق من خلال. خذ 300 ميكرولتر من الكسر واخلطه مع 50 ميكرولترا من الفيروسات المعدية التي تحتوي على 100 مليون نسخة لكل ملليلتر. احتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
قم بإعداد مزيج رئيسي قياسي من qPCR وتخفيفات مكتبة SS-DNA المنقاة كما هو موضح في النص. قم بتشغيل qPCR لتحديد دورة العتبة. بعد الجري ، استخدم منحنى قياسي لتحديد كمية SS-DNA في الجولة 1A والجولة 1X.
ثم احسب ناتج الشطف باعتباره كمية الحمض النووي المربوطة مقسومة على كمية الحمض النووي الأولية وارسم ناتج الشطف مقابل الرقم الدائري. أخيرا ، ارسم منحنيات الذوبان لجولات مختلفة. للحصول على تسلسل عالي الإنتاجية ، حدد مجموعة مناسبة متاحة تجاريا.
قم بإعداد مجموعات متعددة من جولات التحديد التي تمثل الإثراء العالي والمتوسط والمنخفض، بالإضافة إلى التجمع النهائي باستخدام زوج مختلف من الفهارس في المحولات لكل تجمع. ثم أرسل المكتبة النهائية المعدة إلى مرفق التسلسل. لتحليل التسلسل ، تم إلغاء تعدد التسلسلات بواسطة مرفق التسلسل.
قم بإزالة محولات التسلسل وبادئات التحديد باستخدام برنامج سطر الأوامر Cutadapt. ثم استخدم برنامج FASTX-Toolkit لإزالة التسلسلات منخفضة الجودة. ثم ادمج ملفات التسلسل في الاتجاه العكسي مع تلك الموجودة في الاتجاه الأمامي باستخدام وظيفة FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ complement في ملفات الاتجاه العكسي.
ثم استخدم برنامج CAT المدمج لدمج الملفات في ملف واحد. استخدم مجموعة أدوات تحليل FASTAptamer لتحليل إثراء التسلسلات عبر تجمعات التحديد المختلفة. أولا، لاستخدام عدد FASTAptamer ووظائف مجموعة FASTAptamer لتجميع التسلسلات المتشابهة في مجموعات.
بعد ذلك ، استخدم وظيفة إثراء FASTAptamer للحصول على معلومات حول إثراء التسلسلات والمجموعات. تحديد تسلسلات أبتامير المرشحة من معلومات الإثراء التي تم الحصول عليها من خلال تحليل التسلسل. حدد عدة تسلسلات أبتامر وقم بإجراء الفحص الأولي باستخدام مقايسة الربط.
في هذا التحليل ، تم استخدام qPCR لمراقبة تقدم SELEX من aptamers المعدية الخاصة ب SARS-CoV-2. زاد عائد الشطف في البداية مع كل جولة من SELEX واستوى عند الجولتين الثامنة والتاسعة. وبمقارنة منحنيات الانصهار، لوحظ تحول من الذروة عند درجة حرارة انصهار عالية من 77 إلى 79 درجة مئوية.
علاوة على ذلك ، في الجولتين الأخيرتين ، لوحظت ذروة عند درجة حرارة انصهار منخفضة. يتم عرض الوفرة النسبية في القراءات لكل مليون لتسلسل SARS2 AR10 الذي تم الحصول عليه خلال جولات اختيار متتالية. أظهر الهيكل المتوقع ل SARS2 AR10 بنية ثانوية منظمة تحتوي على منطقة حلقة جذعية قد تشارك في التعرف على الفيروس.
بمجرد الحصول على aptamers ، يمكن دمجها في البصريات الكهربائية ، وهو نوع آخر من أجهزة الاستشعار ، لتطوير اختبار الكشف السريع عن الفيروسات التي يمكن أن تبلغ عن عدوى الفيروس. نتصور أنه يمكن الحصول على أبتامير خاص بالمتغيرات المختلفة أو الصور النمطية للفيروس ، مما يجعل من الممكن المراقبة السريعة للمتغيرات التي تشكل أكبر تهديد للمجتمع.
