يمكن تقييم مقاومة الأنسولين في الخلايا الشحمية الأولية ، مما يسمح بدراسة المتبرعين في سياقات فسيولوجية مرضية مختلفة ، مثل العجاف مقابل السمنة ، أو خلايا من رواسب دهنية مختلفة. تحتفظ الخلايا الشحمية الأولية بالعديد من خصائصها الجوهرية ويمكن زراعتها في ظل ظروف محددة لفترة طويلة من الزمن ، مع تحكم صارم في العوامل البيئية الخلوية. لبدء عملية التمايز ، يجب أن تكون الخلايا عند التقاء 80٪.
إذا بدأ التمايز عند التقاء أقل أو أعلى ، فسوف تتمايز الخلايا بشكل أقل أو تفقد قدرتها على التمايز. بعد التضحية بالحيوان ، قم بتطهير الفئران عن طريق فرك 70٪ من الإيثانول. تشريح الأنسجة الدهنية تحت الجلد الأربية من كل فأر وجمعها في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر ، يحتوي على 15 ملليلتر من محلول كولاجيناز من النوع الأول على الجليد.
قطع الأنسجة الدهنية إلى قطع صغيرة بمقص جراحي معقم وهضم العينات عن طريق الحضانة بمحلول كولاجيناز من النوع الأول عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. تحقق من عملية الهضم كل 10 دقائق للتأكد من أنها تعمل ، ولمنع الإفراط في الهضم. قم بالترشيح باستخدام حقنة شبكية بحجم 200 ميكرومتر للتخلص من الأنسجة غير المهضومة بالكولاجيناز ، وقم بتمرير المرشح على حافة الأنبوب لتصريف أكبر عدد ممكن من الخلايا في المحلول.
أضف 15 ملليلتر من DMEM 1٪ BSA البارد لوقف الهضم ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. نضح الطبقة العليا التي تحتوي على الخلايا الشحمية الناضجة ومعظم الطبقة السائلة. أضف 20 ملليلتر من PBS 2٪ FBS البارد إليها وأعد تعليق الحبيبات.
بعد الطرد المركزي مرة أخرى لمدة خمس دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية عن طريق استنشاق الطبقة العليا للقضاء على الخلايا الشحمية والدهون المتبقية. أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لتحلل ACK. احتضان على الجليد لمدة خمس دقائق.
أضف 10 ملليلتر من PBS 2٪ FBS واخلطها. بعد الطرد المركزي لمدة خمس دقائق واستنشاق المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول مضاد ل FC. احتضان على الجليد لمدة خمس دقائق ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب خمسة ملليلتر يلائم رفوف المبردة مسبقا لفاصل الخلايا المغناطيسية.
بعد الطرد المركزي لمدة خمس دقائق والقضاء على المادة الطافية ، أضف 200 ميكرولتر من خليط البيوتين أحادي النسيلة CD 31 وبيوتين الجسم المضاد أحادي النسيلة CD 45 إليه. تخلط جيدا وتحتضن على الجليد لمدة 15 دقيقة. ثم أضف 400 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 400 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
نضح الطافاح واحتضانه في 100 ميكرولتر من الميكروبيدات المضادة للبيوتين لمدة 15 دقيقة على الجليد. أضف 400 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 400 G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، كما هو موضح سابقا. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 350 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS.
لإزالة مجاميع الخلايا ، أو الجسيمات الكبيرة ، من معلقات الخلية المفردة باستخدام مرشح ما قبل الفصل 70 ميكرومتر ، قم بتنشيط المرشح باستخدام 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS. مرر تعليق الخلية من خلال المرشح ، واجمعها في أنبوب نظيف. ثم اغسل الفلتر ب 100 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS.
لإجراء الفصل المغناطيسي للخلايا باستخدام استراتيجية الفصل السلبي ، ضع العينة في الموضع A من الرف المبرد وأنبوبين فارغين في الموضعين B و C لاستعادة الخلايا غير المصنفة والملصقة. ثم قم بتحميل المخزن المؤقت للغسيل وتشغيل المخزن المؤقت في الزجاجات المقابلة. في قسم الفصل ، حدد عدد العينات المراد فصلها وحدد بروتوكول الاستنفاد.
اضغط على تشغيل وابدأ الفصل. في نهاية البرنامج ، استرجع الخلايا غير المصنفة. بعد ذلك ، قم بتغطية لوحة من 12 بئرا بمصفوفة غشاء القاع بإضافة 400 ميكرولتر من مصفوفة غشاء القاع 2.5٪ لتغطية كامل سطح كل بئر.
قم بإزالة المحلول الزائد واترك اللوحة تجف داخل غطاء التدفق الصفحي لمدة ساعة على الأقل. بعد الطرد المركزي لمدة خمس دقائق والتخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط النمو. قم بزرع خلايا السلائف الشحمية ، أو APCs ، في بئر واحد من الصفيحة المكونة من 12 بئرا المطلية مسبقا بمصفوفة غشاء قاعدي بنسبة 2.5٪.
احتضان عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ ، وقم بتغيير الوسط كل 48 ساعة حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪. بعد إزالة الوسط تماما ، اغسل الخلايا ب 350 ميكرولتر من PBS 2٪ FBS. احصد الخلايا ب 350 ميكرولتر من 0.05٪ tripsin EDTA لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية ، وأضف ملليلتر من وسط النمو.
اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 400 جرام لمدة خمس دقائق. قم بتمرير ناقلات الجنود المدرعة إلى 12 صفيحة بئر ، مطلية مسبقا بمصفوفة غشاء قاعدي بنسبة 2.5٪ ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتغيير الوسط كل 48 ساعة حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪.
عند التقاء 80٪ ، قم باستنشاق أي وسط نمو واستبدله ب 500 ميكرولتر من وسط التمايز ، يحتوي على 3.3 بروتين مورفوجيني عظمي نانوي في كل بئر. بعد 48 ساعة ، استبدل الوسيط ب 500 ميكرولتر لكل وسط تمايز جيد ، وكوكتيل التمايز. قم بإزالة الوسط بعد 72 ساعة وأضف 100 نانومول من الأنسولين في 500 ميكرولتر من وسط التمايز الطازج.
بعد 48 ساعة ، حث مقاومة الأنسولين بأربعة نانوجرام لكل ملليلتر من عامل نخر الورم ألفا ، أو TNF alpha. نضح أي وسط تمايز واستبدله ب 500 ميكرولتر من الوسط البسيط 2٪ FBS مع TNF alpha. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، أضف أربعة نانوجرام لكل ملليلتر من TNF alpha في وسط بسيط 0٪ FBS.
قم بتنشيط مسار إشارات الأنسولين بعد 24 ساعة عن طريق إضافة 100 أنسولين نانومول واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ ، كما هو موضح سابقا. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط واغسله ب 500 ميكرولتر من PBS ، بما في ذلك التحكم جيدا بدون علاج الأنسولين. استخراج البروتين وقياس فسفرة علامات إشارات الأنسولين بواسطة لطخة غربية.
يظهر هذا الشكل خلايا سلائف الخلايا الشحمية تحت الجلد عند التقاء 80٪ قبل إحداث التمايز في لوحات الاستزراع المكونة من 12 بئرا ، والخلايا الشحمية الأولية بعد سبعة أيام من إحداث التمايز. تم إثبات مقاومة الأنسولين التي يسببها TNF alpha في الخلايا الشحمية الأولية تحت الجلد من خلال انخفاض الفسفرة التي يسببها الأنسولين لمستقبلات الأنسولين ، وركيزة مستقبلات الأنسولين الأولى ، وبروتين كيناز B أو AKT. تم فحص الغشاء باستخدام مستقبلات الأنسولين المضادة للفسفرة ، وركيزة مستقبلات الأنسولين المضادة للفسفرة الأولى ، و AKT المضاد للفسفرة ، وتم استخدام توبولين المضاد للبيتا كعنصر تحكم في التحميل.
تم تصور الإشارة مع الكشف عن التلألؤ الكيميائي. يوضح هنا البقع التمثيلية والقياس الكمي من ثلاث تجارب مستقلة. عند محاولة هذا الإجراء ، هناك شيء واحد يجب الاهتمام به وهو أن تحريض مقاومة الأنسولين باستخدام TNF alpha يكون مع 2٪ FBS لمدة 24 ساعة ومع 0٪ FBS خلال ال 24 ساعة الماضية.
