يسمح هذا البروتوكول بتصنيع نظائر العظام دون الحاجة إلى تسخين أو مواد كيميائية سامة. بهذه الطريقة ، يتم تشكيل الهياكل العظمية مع إمكانية إصلاح عيب العظام في الإعدادات السريرية باستخدام خلايا المريض نفسه. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن طباعة الحبر العظمي بخلايا حية لتشكيل أي بنية معقدة تشبه العظام ولتوجيه التمايز نحو سلالة تكوين العظام.
علاوة على ذلك ، يمكن تحميل الأدوية في حبر العظام لتعزيز التئام الجروح وتجديد العظام وعلاج أمراض مثل السرطان في نفس الوقت. سيوضح الإجراء جاجان جالاندهرا ، مرشح الدكتوراه في مختبري ، والدكتورة سارة رومانازو ، التي عملت معي ومع الدكتور جالاندهرا في مشاريع مختلفة ، بما في ذلك تطوير هذه التكنولوجيا. ابدأ بإضافة خليط فوسفات هيدروجين الكالسيوم ومسحوق كربونات الكالسيوم إلى بوتقة زركونيا بحيث لا تزيد عن 75٪ ممتلئة.
انقل البوتقة إلى الفرن ، وقم بتسخينها إلى 1،400 درجة مئوية بمعدل خمس درجات مئوية في الدقيقة واحتفظ بها لمدة ثلاث ساعات. إخماد التفاعل عن طريق إزالة البوتقة من الفرن وتركها في الجزء العلوي من كتلة حرارية. اتركه ليبرد تماما قبل التعامل معه.
استخدم ملاطا ومدقة لكسر وطحن كعكة فوسفات ألفا تريكالسيوم بحيث يكون حجم الحبيبات الناتجة 200 ميكرومتر كحد أقصى. أضف كرات زركونيا مثبتة بثلاثة ملليمترات إلى الخليط المطحون ، متبوعا بالإيثانول بنسبة 100٪. قم بتأمين الغطاء وطحنه لمدة ساعتين بمعدل 180 دورة في الدقيقة.
جمع التعليق وفصل الكرات ، وذلك باستخدام 100 ٪ الإيثانول للغسيل. جفف المعلق في فرن على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. أضف المسحوق المجفف إلى برطمانات الطحن مع كرات زركونيا ملليمتر واحد و 100٪ إيثانول بنفس نسب الوزن كما في المرحلة الأولى.
طحن لمدة ساعتين في 180 دورة في الدقيقة. ثم افصلها وجففها في الفرن. أخرج العينة من الفرن.
لصنع حبر العظام ، أضف 630 ميكرولتر من الجلسرين و 130 ميكرولتر من بوليسوربات 80 إلى جرة كرة مل. ثم أضف 100 ملليغرام من فوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة وجرامين من مسحوق فوسفات ألفا تريكالسيوم إلى المحلول وحركه باستمرار باستخدام ملعقة حتى يتجانس. أضف كرة زركونيا 25 ملم ، وقم بتأمين الغطاء ووضعه داخل مطحنة كوكبية لمدة 60 دقيقة بمعدل 180 دورة في الدقيقة ، وتوقف مؤقتا في منتصف الطريق لكشط جوانب الجرة باستخدام ملعقة باستخدام ملعقة.
قم بتحميل الحبر في حقنة ملليلتر. اصنع محلول 10٪ من الجيلاتين من النوع A في 1X PBS كما هو موضح في مخطوطة النص. ضع القارورة المخروطية على المحرض.
ثم أضف 5.796 ملليلتر من أنهيدريد الميثاكريليك واستمر في التحريك في الظلام عند 50 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. إخماد رد الفعل عن طريق تخفيف محتويات القوارير المخروطية مرتين مع PBS. صب في أنابيب 50 ملليلتر وإزالة أنهيدريد الميثاكريليك غير المتفاعل عن طريق الطرد المركزي عند 3000 RCF في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق وجمع المادة الطافية.
قم بغسيل المادة الطافية داخل أنابيب غسيل السليلوز المقطوعة 14 كيلودالتون ضد الماء منزوع الأيونات عند 40 درجة مئوية لمدة خمسة أيام مع التحريك برفق. استبدل الماء منزوع الأيونات كل يوم. استعد للتخزين عن طريق الصب في أنابيب سعة 50 ملليلتر ، وتأمين الغطاء ووضعه في الثلاجة لمدة 12 ساعة.
ثم قم بتجميد العينات باستخدام النيتروجين السائل وتجفيفها على الفور لمدة خمسة أيام عند 54 درجة مئوية تحت الصفر و 0.4 مليبار. قم بتخزين الرغوة الناتجة في الثلاجة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. لتجميع الهلاميات الدقيقة GelMA ، قم بعمل محلول GelMA بالوزن بنسبة 10٪ في PBS عن طريق وزن GelMA المجفف بالتجميد ، وإضافته إلى أنبوب مع PBS وتسخينه في حمام مائي عند 50 درجة مئوية حتى يتم ترطيبه بالكامل.
أضف 37 ملليلترا من الزيت لكل ملليلتر واحد من محلول GelMA إلى الدورق ، مع التأكد من أنه لا يزيد عن 65٪ ممتلئ. قم بإعداد دورق مزدوج على لوح تسخين مع التحريك المغناطيسي عن طريق وضع الكأس الزجاجية التي تحتوي على الزيت داخل كأس زجاجية أكبر. يسخن إلى 40 درجة مئوية مع التحريك.
قم بتحميل محلول GelMA في حقنة وأضفه قطرة إلى زيت التحريك من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر. اترك المستحلب يتوازن لمدة 10 دقائق. خفض درجة حرارة المستحلب إلى 15 درجة مئوية إلى حراريا.
ثبت الكرتين عن طريق إضافة الثلج المجروش إلى الفراغ بين الكأسين. أضف الأسيتون إلى مستحلب GelMA الدوار. صب محتويات الكأس الزجاجية في أنابيب سعة 50 ملليلتر، مع التأكد من غسل جدران الكأس الزجاجية بالأسيتون.
اتركه يرتاح لمدة 20 دقيقة للسماح للمواد الهلامية الدقيقة المجففة بالاستقرار في القاع. تخلص من المادة الطافية واغسل الكبسولات الهلامية مرتين باستخدام الأسيتون. دمج في أنبوب واحد ، وأعلى مع الأسيتون وسونيكات لمدة 10 ثوان.
مرة أخرى ، اغسله بالأسيتون مرتين. يحفظ في الأسيتون في درجة حرارة الغرفة حتى يكون مطلوبا للطباعة. لتحضير تعليق GelMA microgel للطباعة ، قم بصياغة محلول 1٪ بالوزن بالوزن من GelMA في DMEM كما هو موضح في مخطوطة النص.
تبخر الأسيتون من الهلاميات الدقيقة المجففة ووزن المسحوق الناتج في أنبوب. أضف الأسيتون وانقله إلى بيئة معقمة. لتشكيل تعليق microgel ، تبخر الأسيتون من المسحوق داخل خزانة السلامة الحيوية.
بعد التبخر ، أضف DMEM ومحلول 1٪ GelMA في DMEM ومحلول بادئ LAP 2.5٪ لتحقيق جزء تعبئة نهائي بنسبة 30٪ اتركه يرطب بالكامل لمدة 12 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. استزرع الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون في DMEM منخفض الجلوكوز المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تتلاقى. قم بإزالة الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون من قارورة زراعة الأنسجة عن طريق إزالة الوسط وغسله باستخدام PBS معقم.
قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 150 RCF في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. عد الخلايا واحسب ما لا يقل عن 5 × 10 للخلايا الخمس لكل ملليلتر من الهلاميات الدقيقة GelMA. قم بتخصيص الحجم المطلوب لتعليق الخلية لأنبوب منفصل وحبيبات كما هو موضح سابقا.
قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية بعناية باستخدام ماصة ، ولم يتبق سوى حبيبات الخلية. أضف الحجم المطلوب من تعليق ميكروجيل إلى الحبيبات وماصة برفق لأعلى ولأسفل لضمان التوزيع المتساوي. قم بتحميل الخلية المحملة بتعليق ميكروجيل في مفاعل باستخدام ماصة.
باستخدام حقنة ملليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 23 ، قم بإيداع حبر العظم ، وربط الخلية وحبر العظام المحملة بتركيبات GelMA microgel مع مصباح متقاطع للأشعة فوق البنفسجية عند 405 نانومتر لمدة 90 ثانية. انقل تعليق microgel على الفور إلى لوحة بئر بحجم مناسب تحتوي على DMEM كامل. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
استبدل وسط الاستزراع بعد 24 ساعة ، ثم كل 48 إلى 72 ساعة حسب الحاجة. تم تحليل الحبر العظمي عن طريق المسح المجهري الإلكتروني لتحديد هيكله الدقيق ، والذي أظهر تكوين بلورة هيدروكسيباتيت بعد إعداد الحبر ، خاصة في الظروف الجافة. في هذه الدراسة ، تم خلط الخلايا مع الهلاميات الدقيقة GelMA والاحتفاظ بها في المزرعة لمدة تصل إلى خمسة أيام ، إما في معلق هلام دقيق فقط أو في نظام COBICS.
أظهرت الخلايا صلاحية جيدة في وجود حبر العظام ، في اليوم الأول واليوم الخامس ، مما يؤكد أن منتجات ترشيح الحبر لم تكن ضارة بالخلايا. من الضروري التحكم في سرعة التحريك أثناء توليف الميكروجيل لأن التغييرات الطفيفة في التحريك يمكن أن تسبب اختلافات في الحجم. من المهم أيضا ضمان التوزيع المتجانس للخلايا داخل تعليق microgel.
يمكن استخدام نفس البروتوكول للطباعة داخل معلقات الجيلاتين الدقيقة ، والتي تعمل كدعامات قربانية ، تاركة وراءها هياكل عظمية قائمة بذاتها. لكن استخدام GelMA يفتح الطريق أمام تركيبات متعددة الأطوار في وعاء واحد ، مثل واجهات العظم الغضروفي أو الأوتار العظمية.
