تم إنشاء هذا البروتوكول لعزل وتحديد الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة الثانية من الغشاء المخاطي للأنف واستكشاف بعض الآثار والآليات الأساسية ل ILC اثنين في أمراض الأنف. تمكن هذه التقنية الباحثين من عزل ILC اثنين من الظهارة المتوسطة المحلية وكشف التعبير عن المستضد السطحي عن طريق قياس التدفق الخلوي. لا يتضمن أسلوبنا عمليات معقدة.
ومع ذلك ، فإن أحد الأشياء المهمة هو محاولة إزالة اللحم الملتصق بالعظام الصغيرة تماما لتجنب تأثير الأنسجة المجاورة الأخرى قبل البدء في التجربة ، منزل البرية من النوع C57 الأسود ستة ذكور وإناث الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 8 إلى 12 أسبوعا في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض مزودة بمياه المختبر القياسية. لإنشاء نموذج التهاب الأنف التحسسي ، استحلب 50 ميكروغرام من البومين البيضاوي في 0.2 ملليلتر من PBS المعقم الذي يحتوي على ملليغرام من هيدروكسيد الألومنيوم وحقن 50 ميكروغرام من البومين البيضاوي المستحلب داخل الصفاق في كل فأر على صفر وسبعة و 14 يوما. في الأيام 21 و 22 و 23 و 24 و 25 ، قم بغرس الفئران داخل الأنف ب 50 ميكروغرام من البومين البيضاوي المذاب في 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم ، يليه القتل الرحيم للفئران بعد 24 ساعة من التحدي الأخير.
انقع رأس الفأر الرحيم في 75٪ إيثانول لمدة خمس دقائق وتجنب دخول الإيثانول إلى فتحة الأنف الخارجية. ضع البطن لأسفل على طاولة العمليات. قطع الأسنان الأربعة وعند خط الوسط من الرأس قم بعمل شق وقطع الجلد باستخدام المقص.
ثم ، قم بإزالة الفك السفلي ، وقطع الأنف بالكامل على طول نهاية الحنك ، ووضع الأنسجة في طبق بتري 60 ملم يحتوي على خمسة لترات من الثلج البارد PBS. باستخدام المقص والملقط ، قم بإزالة اللحم والعضلات الملتصقة بالعظام. بعد ذلك ، انقل أنف الفأر إلى طبق بتري جديد 60 ملم يحتوي على خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني بارد وغسل العظام.
بعد الغسيل الثاني ، انقل الأنف إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر. تحطيم الأنسجة بما فيه الكفاية ونقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على ملليلتر من العازلة هضم prewarmed. اربط الغطاء وضع الأنبوب عموديا في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية و 120 إلى 150 دورة في الدقيقة لمدة 40 دقيقة.
بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من وسط RPMI 1640 البارد الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني لوقف الهضم. ثم قم بتصفية المحتوى من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون لإزالة الأجزاء الصلبة. بعد الطرد المركزي للمرشح عند 500 جرام لمدة خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية برفق وأعد تعليق الحبيبات في وسط RPMI 1640 بارد الجليد.
لتكرار الطرد المركزي كما هو موضح من قبل ، أعد تعليق حبيبات الخلية في أربعة ملليلتر من وسائط التدرج ذات الكثافة 40٪. بعد ذلك ، أدخل ماصة باستور برفق في قاع الأنبوب لإضافة 2.5 ملليلتر من وسائط التدرج بكثافة 80٪. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 400 جرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع ضبط معدل التسارع والتباطؤ أقل من الترس الثالث.
قبل تصريف الخلايا في الواجهة ، قم بإزالة الطبقة العليا من الشوائب لتجنب التلوث المحتمل. ثم استخدم ماصة لتصريف طبقة الخلايا أحادية النواة عند واجهة وسائط متدرجة بكثافة 40٪ × 80٪ في أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على ملليلتر من الجليد البارد. اغسل الخلايا بالثلج البارد PBS مرتين.
حصاد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 500 غرام عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات الخلية في مخزن تلطيخ وأجهزة طرد مركزي مرة أخرى لمدة خمس دقائق عند 500 G.تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق واحتضان الخلايا في محلول مانع 80 ميكرولتر لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في حالة مظلمة.
أضف ميكرولترا واحدا من صبغة الصلاحية القابلة للتثبيت 520 مباشرة قبل إضافة 20 ميكرولترا من كوكتيل الأجسام المضادة لتلطيخ السطح من التخفيف المناسب للعينة. أيضا ، قم بتعيين الأجسام المضادة المطابقة للنمط المتماثل والتألق ناقص واحد كعناصر تحكم سلبية. بعد ذلك ، اغسل الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ عن طريق الطرد المركزي عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
ثم أعد تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ. أخيرا ، أضف 50 ميكرولترا من حبات العد المطلقة الدوامة إلى الخلايا الملطخة. تحريكهم وإخضاعهم لتحليل التدفق الخلوي.
أظهر نموذج الفئران المستحثة بالبويضات الذي تم تطويره لاستكشاف دور الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة الثانية أن تواتر فرك الأنف والعطس في فئران التهاب الأنف التحسسي كان أعلى بكثير منه في المجموعة الضابطة. في الغشاء المخاطي للأنف للفئران الضابطة السليمة ، تم تحديد حوالي 2 إلى 3٪ من الخلايا السلبية النسب و CD 45 الإيجابية. تراوح العدد المطلق للخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة الثانية من 2،000 إلى 4،000.
أشار تحليل قياس التدفق الخلوي إلى زيادة ملحوظة في العدد الإجمالي للخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة الثانية في الغشاء المخاطي للأنف التحسسي مقارنة بالفئران الضابطة السليمة. تم الكشف عن تعبير أعلى ل CD 226 على المجموعة الثانية من الخلايا اللمفاوية الفطرية في الفئران المصابة بالتهاب الأنف التحسسي مقارنة بالفئران الضابطة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تنظيم متوسط شدة مضان CD 226 بشكل كبير في الفئران AR.
كن على دراية بخطوات إزالة اللحم الملتصق بعظم الأنف ، وتحديد معدل التسارع والتباطؤ عند الطرد المركزي للوسائط واستنزاف الخلايا أحادية النواة. يمكن أن يكون ثنائي ILC المحدد موقفا لتوصيف قياس التدفق الخلوي المصنف لزراعة الخلايا أو تحفيزه في المختبر ، مما يساعد في استكشاف المخاطر المحددة لثنائيات ILC في أنسجة الأنف. هذا الإجراء لعزل وتوصيف الخلايا الليمفاوية ، خاصة في الخلايا اللمفاوية الفطرية في الغشاء المخاطي للأنف ، يجعل هذا البروتوكول مرجعا أوليا للباحثين الذين يستكشفون البيئة المناعية الأنفية المحلية.
