لقد طورنا منهجية رسم خرائط FRET التي تسمح بتحديد وتوصيف مواقع ربط الليغاند ، واتجاه الوحدة الفرعية ، والتغيرات التوافقية المرتبطة بربط الليغاند ، والحركات الديناميكية للبروتينات. ميزة هذه التقنية هي أنه يمكن إجراؤها في محلول ويمكن للجزيئات التحرك بحرية. المسافات التي تقاس بهذه التقنية مناسبة للأنظمة البيولوجية.
FRET قابل للتطبيق على نطاق واسع على العديد من الأنظمة. يعزز رسم الخرائط رصد التغيرات الهيكلية والديناميكية في أي نظام جزيئي حيوي ، وهو فعال بشكل خاص إذا كانت هناك معلومات هيكلية ثلاثية الأبعاد. بعد تنقية البروتين ، فإن الجزء الأصعب هو وضع العلامات بكفاءة عالية ، وإزالة الصبغة الحرة.
بالنسبة للتجارب ، من المفيد الحصول على أقل قدر ممكن من الصبغة الحرة. للبدء ، اختر مواقع وضع العلامات في غضون 25 إلى 75 أنغستروم من موقع الربط العقابي ، وفي المناطق الثابتة نسبيا من البروتين. ستحدد المسافة زوج صبغة FRET المحدد الذي سيتم استخدامه.
حدد مواقع وضع العلامات في مناطق البروتين المتميزة نسبيا عن بعضها البعض. لذلك تصف المواقع رؤوس المثلث ، مع موقع الربط العقابي الموجود في الوسط. لقياس قيم R0 ، اعتمادا على حجم وحجم cuvette المطلوب ، قم بإعداد عينتين من البروتين بنفس تركيز البروتين الكلي.
واحد مع البروتين المسمى مع صبغة المتبرع فقط ، وواحد مع البروتين المسمى مع صبغة المتقبل فقط. قم بتشغيل مقياس الفلورومتر وافتح برنامج الاستحواذ الطيفي والتحليل في برنامج FluorEssence ، إذا كنت تستخدم مقياس الطيف الفلوري. انقر فوق M الأحمر لتوصيل الكمبيوتر بالجهاز واختر أطياف الانبعاثات.
أدخل معلمات المسح الضوئي باستخدام عنصر قائمة تجميع التجربة، مثل الطول الموجي للإثارة، ونطاق فحص الانبعاثات، ودرجة الحرارة، وتغيير موضع العينة. انقر فوق RTC وإعدادات الأداة المحسنة كما هو موضح في المخطوطة ، من خلال مراقبة انبعاث التألق في الذروة باستخدام طول موجي مثير محدد عند الحد الأقصى لامتصاص الصبغة. ضع عينة البروتين المصنفة من قبل المتبرع في حامل العينة، وانقر فوق تشغيل لإنشاء مسح انبعاث للبروتين الموسوم بصبغة المتبرع فقط، عن طريق إثارة العينة عند الحد الأقصى لامتصاص الصبغة، والمسح الضوئي فوق ذروة الانبعاثات.
حدد خط أساس للفحص عن طريق تمديد المسح الضوئي عند 25 إلى 50 نانومتر بعد نهاية الذروة. قياس العائد الكمومي للبروتين المتبرع فقط عن طريق إجراء قياسات الامتصاص والتألق على عينات بتركيزات مختلفة ، كما هو موضح في مخطوطة النص. قم بإعداد البروتين المانح فقط ، والبروتين المتقبل فقط ، وعينات البروتين المتبرع المتقبل ، بنفس التركيز.
احصل على المسح الضوئي للمتبرع فقط لتوليد أطياف الانبعاثات الفلورية. قم بإثارة المحلول عند الحد الأقصى لامتصاص صبغة المتبرع ، ومسح قمم الانبعاثات لدى المتبرع والمتقبل. إما تبادل العينة إلى البروتين المتقبل فقط ، أو تغيير العينة تغيير موقعك إلى كوفيت يحتوي على البروتين المتقبل فقط.
احصل على فحص انبعاث للبروتين الموسوم بصبغة المستقبل فقط. إثارة العينة عند الطول الموجي للإثارة المانحة. استبدل العينة بعينة البروتين بين المتبرع والمتقبل أو غير العينة غير موضعك إلى الكوفيت الذي يحتوي على البروتين المسمى بالمتبرع والمتقبل.
احصل على فحص انبعاث لعينة البروتين من المتبرع المتقبل باستخدام نفس الإعدادات. بالنسبة لجميع الأطياف، قم بتصحيح تألق الخلفية عن طريق طرح أعداد الخلفية التي تم قياسها في نهاية الفحص. استخدم برنامج عرض رسومي 3D مثل PyMOL لتعيين المسافات على الهيكل ، عن طريق إدخال الأوامر مباشرة من البرنامج النصي في نافذة الأوامر مع معلومات المسافة المناسبة.
قم بإنشاء غلاف لكل مسافة تم قياسها ، والخطأ المقترن. قم بتعيين الموقع من خلال تقاطع الأصداف المختلفة. تم تعيين موقع ربط ببتيد الإشارة باستخدام ثلاثة مواقع مختلفة على SecA و SecYEG ، وأربعة مواقع مختلفة على ببتيد الإشارة.
تقوم تجارب FRET بين مناطق مختلفة من ما قبل البروتين وثلاثة مواقع متميزة على بروتينات SecA و SecYEG بتعيين موقع واتجاه ربط ما قبل البروتين. تم تحديد موقع الربط العقابي لببتيد الإشارة سابقا على أنه إصبع الحلزوني الثنائي ، واقترح ذيل SecA C-terminal اتجاها موازيا لإصبع الحلزون. تم الحصول على أطياف FRET ذات الحالة الثابتة بين SecA37 و PhoA2 و PhoA22.
يشير الانخفاض في كثافة المتبرع إلى أن الطاقة الأكبر تنتقل من PhoA22. بالنسبة إلى موقع PhoA2 ، الذي يقع بعيدا عن SecA37. أظهرت أطياف الاضمحلال الفلوري التي تم حلها عبر الزمن أن مجمع المتبرع المتقبل لديه اضمحلال متجانس أقصر بما يتفق مع نقل الطاقة المرتبط بمسافة واحدة.
أظهرت قذائف مسافة FRET التي تم بناؤها بين بقايا SecA PhoA2 ، والمواقع المثلثة ، أن كل قذيفة تتقاطع مع إصبع الحلزون الثنائي ، موقع الربط المفترض ، والذي يظهر باللون الأخضر. المنطقة المتقاطعة أصغر من كل قشرة FRET وتشمل مساهمة كبيرة من السقالة الحلزونية. تصف قذائف مسافة FRET المحددة بين بقايا PhoA2 والمواقع المصنفة ، منطقة أصغر تقع بالقرب من طرف إصبع الحلزون وفم قناة SecYEG.
تقع هذه المنطقة المتقاطعة في الطرف الآخر من إصبع الحلزون الثنائي من PhoA2. تتضمن الأشياء المهمة التي يجب مراعاتها الاختيار السليم لمواقع وضع العلامات لتثليث منطقة الاهتمام ، وقياس الغلة الكمومية لكل موقع ، وإزالة جميع الصبغة الحرة. تتوافق هذه الطريقة مع المعلومات الهيكلية التي تم الحصول عليها بطرق مثل الرنين المغناطيسي النووي أو علم البلورات بالأشعة السينية.
عندما يتم وضع نتائج FRET في سياق هيكلي ، يمكن أن تعزز المعلومات الموجودة.
