في بروتوكول JoVE هذا ، نستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة القائم على القطيرات لتوصيف البنية البيولوجية للخلايا العصبية الودي القلبية في الصحة والمرض. تمكن هذه الطريقة من تسلسل مجموعة كبيرة من العينات العصبية على مدى فترة من الزمن. من خلال سحب النوى المشفرة باستخدام علامات التصنيف oligos ، تسمح هذه الطريقة بتعدد الإرسال للعينات.
تحمل هذه الطريقة إمكانية توسيعها لتشمل تسلسل الخلايا العصبية للعقد البشرية ، والتي كانت صعبة بسبب حجم خليتها الكبير وصعوبة جمع العينات في وقت واحد. سيوضح الإجراء كوني فان مونستيرين ، فني أبحاث ، و Lieke van Roon ، طلاب الدكتوراه من مختبرنا ابدأ بجمع جميع المواد اللازمة للتشريح ، ثم قم بإصلاح الماوس على لوحة التشريح. بلل الماوس بالإيثانول بنسبة 70٪ لتقليل تشتت الفراء.
افتح جلد منطقة الرقبة عن طريق إجراء قطع خط الوسط بالمقص. تحت المجهر الاستريو ، حرك الغدد تحت الفك السفلي جانبا وأزل عضلة الخشاء القصية لفضح الشريان السباتي المشترك وتشعبه ، وكذلك العقد العنقية العليا وإزالة الأنسجة المرتبطة به. تشريح تشعب الشريان السباتي الأيمن والأيسر والأنسجة المرتبطة به.
انقل كل قطعة من الأنسجة المشوهة إلى طبق بتري منفصل بطول 3.5 سم يحتوي على PBS بارد. حدد موقع العقد العنقية العليا المرتبطة بتشعب الشريان السباتي. تنظيف العقد العنقية العليا عن طريق إزالة الشريان والأنسجة المرفقة.
لتشريح العقد النجمية ، قم بعمل قطع خط الوسط في البطن ، يليه فتح الحجاب الحاجز والجدار الصدري البطني. إزالة الرئتين ، تليها القلب ، لفضح الصدر الظهري. على مستوى الضلع الأول ، حدد موقع العقد النجمية اليسرى واليمنى الأمامية الجانبية للعضلة القولونية الطويلة.
تشريح كل من العقد النجمية مع ملقط عن طريق إزالة الأنسجة المحيطة. انقلها إلى أطباق بتري بطول 3.5 سم تحتوي على PBS بارد. باستخدام الملقط ، انقل العقد العنقية المتفوقة والعقد النجمية لفصل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول Trypsin-EDTA بنسبة 0.25٪ إلى كل أنبوب واحتضنه في حمام مائي يهتز.
اسمح للعقد بالاستقرار في الجزء السفلي من أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من وسط العقدة. إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الكولاجيناز من النوع 2 واحتضنه في حمام مائي يهتز.
بعد الحضانة ، أعد تعليق العقد في محلول الكولاجيناز عن طريق السحب حتى لا يتم اكتشاف كتل الأنسجة. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر المستخدم سابقا والذي يحتوي على وسط زراعة العقد مع تعليق Trypsin-EDTA. الطرد المركزي لتعليق الخلية والتخلص من الخلية الخارقة.
أعد تعليق الكريات في 270 ميكرولتر من مصل البقر الجنيني وانقله إلى 1 ملليلتر من التبريد. لحساب الخلايا ، امزج 5 ميكرولترات من تعليق الخلايا العقدية مع خمسة ميكرولترات من صبغة زرقاء تريبان بنسبة 0.4٪. قم بتحميل الخليط في مقياس للخلايا الدموية واحسب إجمالي أعداد الخلايا الحية تحت المجهر.
بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى كل تبريد واخلطه جيدا. انقل الكريوفيالات إلى حاوية لتجميد الخلايا وضعها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر بين عشية وضحاها. تحضير أنابيب 15 ملليلتر مع مصفاة 30 ميكرومتر في الأعلى.
قبل شطف المصفاة مع 1 ملليلتر من وسط العقدة. أخرج الكريوفيالات من النيتروجين السائل وقم بإذابتها على الفور في حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى يتم ترك حبيبة صغيرة من الجليد في التبريد. أضف 1 ملليلتر من وسط العقدة إلى كل مبرد مع هز القارورة بعناية لاستعادة الخلايا العقدية.
قم بتحميل تعليق الخلايا العقدية على المصفاة وشطفه ب 4 إلى 5 ملليلتر من وسط العقدة. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية المتوترة. قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل الخلايا.
انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي صغير منخفض الارتباط سعة 0.5 ملليلتر. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية. جهاز طرد مركزي مع دوار دلو متأرجح ضروري من الآن فصاعدا.
بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة 45 ميكرولتر من supernatant دون إزاحة بيليه الخلية. أضف 45 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل المبرد ، ممزوجا بلطف عن طريق السحب ، واحتضن الخلايا لمدة 8 دقائق على الثلج ، ثم أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل النوى الباردة إلى كل أنبوب. الطرد المركزي لتعليق النوى وإزالة 95 ميكرولتر من supernatant دون تعطيل بيليه النوى.
أضف 45 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل النوى المبردة إلى الكريات ، وكرر الطرد المركزي ، وأزل السوبرناتانت. إلى حبيبات النواة ، أضف 50 ميكرولتر من ST-SB وماصة بلطف حتى يتم إنعاش النوى بالكامل ، ثم أضف 5 ميكرولترات من كاشف منع FC واحتضنها لمدة 10 دقائق على الجليد. بعد ذلك ، أضف 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة أحادية النواة واحتضنها لمدة 30 دقيقة على الجليد.
بعد الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من ST-SB إلى كل أنبوب. الطرد المركزي للتعليق وإزالة 145 ميكرولتر من supernatant دون تعطيل بيليه النوى. كرر الطرد المركزي وإزالة supernatant.
أعد تعليق حبيبات النوى في 50 ميكرولتر من ST-SB واخلطها بلطف. خذ 5 ميكرولترات من تعليق النوى وامزجها مع 5 ميكرولترات من 0.4٪ من أزرق التربان لحساب النوى تحت المجهر. مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي لتعليق النوى وإعادة تعليق حبيبات النوى في ST-SB لتحقيق تركيز نووي مستهدف من 1000 إلى 3000 نواة لكل ميكرولتر.
اسحب العينات لتحقيق العدد المطلوب من الخلايا. أظهر تحليل مراقبة الجودة لإعداد المكتبة أن cDNAs المشتقة من الوسم oligo أصغر من 180 زوجا أساسيا. تمثل الذروة الواسعة من 300 إلى 1000 زوج أساسي مكتبة تعبير جيني عالية الجودة ، في حين أظهرت ذروة محددة من 194 زوجا أساسيا مكتبة الهاشتاج oligo.
كشف تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة عن 12 مجموعة تم تصورها بواسطة UMAP وتم توزيع الأجسام المضادة للوسم بين جميع المجموعات. تم تأكيد وضع علامات محددة بواسطة علامة التصنيف oligos من خلال تعبير Xist. علامات التصنيف 1 إلى 4 وصفت الإناث ، في حين أن 5 إلى 8 عينات الذكور المصنفة.
تم التحقق من جودة ودقة بيانات التسلسل بواسطة النصوص الرئيسية مثل TH و DBH و SNAP25 في المجموعتين 5 و 7 للخلايا العصبية المتعاطفة ، و S100B في المجموعات من 0 إلى 3 للخلايا الدبقية الساتلية ، و PECAM 1 في المجموعة 4 للخلايا البطانية ، و ACTA2 في المجموعة 8 للخلايا اللحمية . عند محاولة هذه الطريقة ، من المهم أن تتذكر التحضير السليم والمعدات المناسبة مثل مقص التشريح الدقيق والملقط الحاد وأجهزة الطرد المركزي مع دوار دلو متأرجح ضرورية. النهج التدريجي لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة للعقد القلبية الخارجية الودية لديه القدرة على التطبيق الواسع في توصيف العقد التي تعصب الأعضاء والأنسجة الأخرى ذات الصلة في الصحة والمرض.
