يمكن أن تؤثر بكتيريا الأمعاء على عمليات فسيولوجية متعددة لمضيفات الحشرات. يعد إعداد اليرقات المحورية والحفاظ عليها أداة قوية لدراسة وظائف بكتيريا الأمعاء. المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هي أن زراعة الأنسجة النباتية تستخدم للحصول على أوراق خالية من الجراثيم إلى الحشرات التي تأكل الأوراق المحورية الخلفية المشتقة من بيض معقم على السطح ، وأن هذه الطريقة غير مقيدة بالوجبات الغذائية الاصطناعية.
هذه الطريقة مريحة وتزيد من وضوح الحفاظ على الحشرات المحورية لدراسات بكتيريا الأمعاء المستقبلية ، خاصة بالنسبة للحشرات غير النموذجية التي لا تحتوي على أنظمة غذائية اصطناعية متطورة. الحفاظ على السكان P.versicolora في غرفة النمو عند 27 درجة مئوية والرطوبة النسبية 70٪ ، مع ضوء 16 ساعة وثماني ساعات مظلمة فترة ضوئية. ضع الحشرات في صناديق بلاستيكية مثقوبة بورق مائل ممتص للرطب ، وأطعمها فروع الحور الطازجة.
رش الماء النظيف على الورق الممتص للحفاظ على الرطوبة ، وتغيير الفروع كل يومين. عزل البالغين لوضع البيض بعد الجرو ، وإطعامهم أوراق طرية للحصول على المزيد من البيض. في غضون 24 ساعة ، اجمع البيض الذي تم وضعه حديثا وضعه على ورق ممتص للرطوبة لمدة 60 ساعة لإعداد يرقات axenic.
تحضير MS المتوسطة في ملليغرام واحد لكل ملليلتر حمض الخليك ألفا النفثالين أو محاليل مخزون NAA. في غطاء السلامة الأحيائية، أضف 50 ميكرولترا من محلول مخزون NAA إلى 500 ملليلتر من وسط التصلب المتعدد، ورجه ليخلط جيدا. ثم صب ما يقرب من 50 ملليلتر لكل حاوية زراعة الأنسجة وانتظر التصلب.
تعقيم المشارط والملقط في لهب مصباح الكحول في غطاء محرك السيارة للسلامة الأحيائية. قطع ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات شرائح الساق مع براعم قمية أو براعم جانبية من شتلات الحور في شهر واحد تقريبا من النمو ، وإدخالها في وسط الاستزراع ، واحد أو اثنين من شرائح الساق لكل حاوية. احتضان هذه الأجزاء الجذعية في غرفة النمو لمدة 30 يوما تقريبا.
واستخدم هذه الأوراق الخالية من الجراثيم لإطعام اليرقات المحورية. أطباق الأوتوكلاف بيتري ، فرش الطلاء ، ورق الترشيح ، الماء المقطر في طبق بتري يحتوي على وسط أجار LB. ضع الأوراق مع البيض الملتصق في طبق بتري.
ثم قم بإزالة البيض بعناية من الأوراق باستخدام الملقط ونقله إلى طبق بتري آخر. اغسل هذه البيض بنسبة 75٪ من الإيثانول لمدة ثماني دقائق. ثم كرر الغسيل أربع مرات بالماء المعقم.
انقل البيض إلى وسط LB agar للحفاظ على الرطوبة للفقس. ضع طبق بتري في غرفة النمو وانتظر حتى يفقس البيض في غضون 24 ساعة. في غطاء السلامة الأحيائية، قم بتبليط ثلاث قطع من ورق الترشيح الرطب في طبق بتري، وضع أوراق الحور الخالية من الجراثيم على الورق.
جمع اليرقات ووضعها على الأوراق. ختم طبق بتري مع Parafilm ، واحتضنه في غرفة النمو. تغيير الأوراق كل يومين.
بالنسبة للمجموعات التي يتم تربيتها تقليديا ، انقل البيض من الأوراق إلى طبق بتري يحتوي على ورق ترشيح رطب ، وقم بإطعام هذه اليرقة بأوراق الحور الخالية من الجراثيم. اختر عشوائيا ثلاث يرقة أولى وثانية وثالثة من المجموعات الخالية من الجراثيم والتي يتم تربيتها تقليديا. تشريح يرقات instar الثالثة بمقص معقم وملقط تحت مجهر ستيريو ، وجمع أحشائها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
جمع اليرقات الأولى والثانية سليمة instar في الأنابيب. أضف 100 ميكرولتر من PBS وثلاث كرات فولاذية إلى أنابيب 1.5 ملليلتر ، وطحن الأنسجة إلى متجانسات باستخدام مجانس ضرب الخرزة. أضف 100 ميكرولتر من المتجانس إلى وسط LB agar وطبقه باستخدام قضيب نشر زجاجي معقم.
احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ثم مراقبة المستعمرات البكتيرية. استخراج الحمض النووي الكلي للأنسجة التي تم الحصول عليها سابقا باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي، وقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
قم بتضخيم جين 16S rRNA البكتيري باستخدام الاشعال العالمي 16S rRNA مع PCR ، وإعداد التفاعل كما هو موضح في مخطوطة النص. تخزين منتجات PCR في أربع درجات مئوية حتى مزيد من التحليل. امزج منتجات PCR مع صبغة الحمض النووي وقم بتحليلها باستخدام الرحلان الكهربائي على هلام أغاروز 1٪ في مخزن مؤقت 1X TAE.
استخدم 10 ميكرولترات من علامة الحمض النووي كمرجع. راقب الجل باستخدام محول الأشعة فوق البنفسجية ، وابحث عن الجزء المستهدف حول 1،500 زوج قاعدة. على الرغم من عدم ملاحظة أي مستعمرات بكتيرية في أي مجموعة خالية من الجراثيم ، إلا أنها لوحظت في جميع المجموعات التي يتم تربيتها تقليديا ، مما يشير إلى أن اليرقات من البيض المعقم الذي تم تغذيته بأوراق الحور المزروعة بالأنسجة لا تحتوي على بكتيريا.
ظهرت نطاقات PCR المكونة من 1،500 زوج أساسي في جميع المجموعات التي يتم تربيتها تقليديا. في المقابل، لم يلاحظ أي نطاق في المجموعات الخالية من الجراثيم أو التحكم السلبي، مما يعني عدم وجود بكتيريا الأمعاء في يرقات أكسينيك. بالنسبة لأنواع الحشرات ذات البيض الصغير ، يجب تحسين أنواع المطهرات ومدة التعقيم.
بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون النباتات الداخلية في النباتات المستزرعة بالأنسجة ملحوظة. يوفر هذا البروتوكول طريقة جديدة للحفاظ على الحشرات الخالية من الجراثيم ، وهي أداة مفيدة لتسهيل دراسات التفاعل بين البكتيريا والبكتيريا بين الحشرات والأمعاء ، خاصة بالنسبة للحشرات غير النموذجية التي لا تحتوي على أنظمة غذائية اصطناعية متطورة.
