تسمح التركيبات البصرية الوراثية التي يتم تسليمها فيروسيا بالتوصيف الكهربي التفصيلي لعلم وظائف الأعضاء واللدونة لنقاط الاشتباك العصبي المحددة في شرائح الدماغ الحادة. تتمثل المزايا الأساسية لتنشيط نقاط الاشتباك العصبي بصريا في القدرة على دراسة المسارات طويلة المدى ، والتحفيز الانتقائي للمحاور العصبية غير المنفصلة تشريحيا. ستوضح الإجراء الدكتورة ليزا كينافان ، باحثة مشاركة من مختبرنا.
للبدء ، قم بتحميل حقنة هاملتون في مضخة حقنة حقن مجهرية متصلة بذراع متحرك مثبت على إطار مجسم. ثم ضع حصة من الفيروس بحجم خمسة ميكرولتر في جهاز طرد مركزي دقيق. أدر الأنبوب لبضع ثوان وماصة اثنين ميكرولتر من المستحضر الفيروسي في غطاء الأنبوب.
لملء المحقنة بالمستحضر الفيروسي ، شاهد طرف الإبرة بمجهر جراحي. ثم ضع بلعة الفيروس يدويا على طرف الإبرة ، واسحب مكبس المحقنة باستخدام أدوات التحكم في المضخة. اضبط حجم حقن المضخة على 300 نانولتر ومعدل التدفق على 100 نانولتر في الدقيقة.
قم بتشغيل المضخة وتأكيد التدفق السليم من خلال مراقبة قطرة الفيروس عند طرف الإبرة. امتصاص الفيروس على برعم القطن ، وتنظيف الإبرة مع 70 ٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، باستخدام مسامير الضبط الموجودة على الإطار المجسم ، انتقل إلى طرف الإبرة إلى bregma ، ولاحظ القياسات المجسمة التي لوحظت على موازين الورنية الثلاثة على الإطار.
اجمع أو اطرح هذه المسافات من إحداثيات bregma. اصنع ثقبا في سطح الجمجمة باستخدام مثقاب دقيق مثبت على الذراع المجسم. أدخل الإبرة في الدماغ عند الإحداثي الظهري البطني المحدد مسبقا ، وبث حجم محدد مسبقا من المستحضر الفيروسي.
بعد التسريب، اترك الإبرة في الموقع لمدة 10 دقائق للسماح بانتشار البلعة. ثم قم بإزالة الإبرة ، وقم بتشغيل المضخة للتأكد من عدم انسداد الإبرة. بعد أسبوعين من الحقن الفيروسي ، قم بالقتل الرحيم للفأر ، وتشريح الدماغ بالكامل بسرعة ، ونقله إلى محلول قطع السكروز.
باستخدام ملعقة صغيرة معدنية ، التقط الدماغ ، وتخلص من المحلول الزائد ، وضعه على ورقة ترشيح. باستخدام مشرط ، قم بإزالة المخيخ ، وقطع المخ في المستوى الإكليلي في منتصف طوله تقريبا. النصف الخلفي هو كتلة الأنسجة LEC.
أعد كتلة الأنسجة والدماغ المتبقي إلى محلول قطع السكروز. بعد ذلك ، ضع قطرة من غراء cyanoacrylate على مرحلة اهتزازية ، وانشرها في طبقة رقيقة. ثم باستخدام ملعقة صغيرة ، اختر كتلة أنسجة LEC ، وانقلها إلى رقعة الغراء ، بحيث يلتصق القطع الإكليلي الأمامي.
قم بتثبيت المرحلة في غرفة الأنسجة الاهتزازية ، وصب بسرعة محلول قطع السكروز الكافي لغمر الأنسجة. بعد توجيه السطح البطني لكتلة الأنسجة نحو الشفرة ، قم بقص شرائح بسمك 350 ميكرومتر من البطني إلى الظهري باستخدام سرعة تقدم بطيئة للشفرة. عادة ، يمكن الحصول على سبع شرائح لكل نصف الكرة الأرضية.
انقل الشرائح إلى غرفة تجميع الشرائح. ثم ضع غرفة التجميع في حمام مائي 34 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل العودة إلى درجة حرارة الغرفة. ضع ما تبقى من الدماغ في بارافورمالدهيد لمدة 48 ساعة.
لتحديد الخلية المستهدفة ، ضع الشريحة في غرفة التسجيل ، وشل حركتها باستخدام مرساة شريحة. تحت التكبير المنخفض ، باستخدام إضاءة الأشعة تحت الحمراء ، انتقل إلى طبقة LEC الخامسة. ثم قم بالتغيير إلى هدف الغمر المائي عالي التكبير ، وحدد الخلايا العصبية الهرمية.
حدد موضع الخلية على الشاشة بشريط. بعد ذلك ، لتشكيل مشبك تصحيح خلية كاملة ، قم بتصنيع ماصة دقيقة من زجاج البورسليكات ، واملأها بمحلول التسجيل داخل الخلايا. ضع الماصة الدقيقة المملوءة في حامل القطب الكهربائي وقم بتطبيق ضغط إيجابي عن طريق النفخ بقوة في قطعة الفم المتصلة بالمنفذ الجانبي لحامل القطب الكهربائي.
ارفع هدف المجهر بحيث يتشكل الغضروف المفصلي وأدخل القطب في الغضروف المفصلي حتى يمكن رؤيته على المجهر. افتح نافذة اختبار الختم ، وحدد ما إذا كانت مقاومة الماصة من ثلاثة إلى خمسة ميغا أوم. ثم المس الخلية المحددة بطرف ماصة ، مما يؤدي إلى مسافة بادئة في غشاء الخلية.
بعد ذلك ، قم بتطبيق ضغط سلبي عن طريق الشفط في لسان حال الفم ، مما يزيد من مقاومة الماصة. استمر في تطبيق الضغط السلبي تدريجيا حتى يتمزق غشاء الخلية ، مما يؤدي إلى عابرة سعة الخلية بأكملها. للدخول إلى تكوين المشبك الحالي ، استخدم مصباح LED مثبتا موجها إلى مسار ضوء المجهر مع مكعبات المرشح والبصريات المناسبة ، وقم بتطبيق نبضات ضوئية على الشريحة عبر هدف 40X.
قم بتوصيل قطارات من نبضات ضوئية متعددة بسرعة خمسة هرتز و 10 هرتز و 20 هرتز للتحقيق في خصائص الإطلاق قبل المشبكي. للسماح للخلية الحيوية بملء الخلايا العصبية ، انتظر لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد إدخال تكوين الخلية بأكملها. في مشبك الجهد ، راقب سعة الغشاء ومقاومة الإدخال.
ثم اسحب الماصة ببطء على طول زاوية الاقتراب بعيدا عن سوما الخلية ، مع ملاحظة الاختفاء البطيء لعابري السعة وتيار الغشاء ، مما يشير إلى إعادة إغلاق غشاء الخلية وتشكيل رقعة خارجية للخارج عند طرف الماصة. ضع الشريحة في بارافورمالدهيد في طبق من 24 بئرا واحتضانها طوال الليل. باستخدام وسيط OCT ، قم بتوصيل كتلة الأنسجة بقرص عينة cryostat.
لتجميد الأنسجة ، ضع الأيزوبنتان في حاوية مناسبة واغمر قرص العينة ، وتأكد من أن الأنسجة أعلى من مستوى الأيزوبنتان. ثم اخفض حاوية الأيزوبنتان إلى نيتروجين سائل ، واترك الأنسجة تتجمد. بمجرد تجميد الأنسجة تماما ، اترك كتلة الأنسجة في غرفة التبريد عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 دقيقة للسماح بتوازن درجة حرارة الكتلة.
بعد التوازن ، قم بقص أقسام بسمك 40 ميكرومتر في cryostat ، واستخدم فرشاة رسم دقيقة لتوجيه الأقسام بعيدا عن الشفرة. قم بلصق هذه الأقسام المجمدة على شريحة مجهر زجاجي مطلي بالبولي L-lysine بدرجة حرارة الغرفة عن طريق لمس الشريحة إلى الأقسام. بعد إضافة 150 ميكرولتر من وسط التركيب إلى كل شريحة ، ضع زلة الغطاء ، وقم بإزالة أي فقاعات هواء بالضغط برفق على انزلاق الغطاء.
قم بتغطية الشرائح للحماية من التبييض الضوئي ، واتركها تجف في الهواء لمدة 12 ساعة. ثم باستخدام مجهر مضان ، افحص موقع موقع الحقن الفيروسي. لتلطيخ البيوسيتين ، احتضن الشرائح في 3٪ بيروكسيد الهيدروجين في PBS لمدة 30 دقيقة لمنع أي نشاط بيروكسيديز داخلي.
ثم اغسل شرائح الدماغ باستخدام برنامج تلفزيوني حتى لا تظهر فقاعات أكسجين أخرى. بعد ذلك ، احتضن الشرائح لمدة ثلاث ساعات في محلول HRP 1٪ من الأفيدين والبيوتينيل في PBS يحتوي على 0.1٪ Triton X-100. بعد ست عمليات غسل PBS ، احتضن كل شريحة في محلول DAB حتى يصبح تلطيخ الخلايا الحيوية للهياكل العصبية مرئيا.
أوقف التفاعل عن طريق نقل الشرائح في PBS الباردة. ثم قم بتركيب الشرائح على شرائح المجهر الزجاجي باستخدام فرشاة. بعد إزالة PBS الزائدة ، أضف وسيط التركيب.
غطي الشرائح باستخدام زلات الغطاء واتركيها تجف في الهواء ، كما هو موضح سابقا. تم تحديد موقع خلية هرمية صحية ومصححة. إذا كان تحديد الخلية بعد المشبكي مطلوبا ، فيجب تحديد الخلية التي تعبر عن علامة الفلورسنت باستخدام بصريات واسعة المجال.
أدت نبضات الضوء المفردة التي تبلغ ميلي ثانية إلى إمكانات استثارة بصرية وراثية بسيطة بعد المشبكية. يتم فحص اللدونة قصيرة المدى للمشبك من خلال تطبيق خمسة و 10 و 20 هيرتز من التحفيز الضوئي. أثناء التحقيق في اللدونة على المدى الطويل ، تسببت إضافة كارباكول ناهض الكوليني إلى aCSF المنتشر لمدة 10 دقائق في انخفاض طويل الأمد كان لا يزال واضحا بعد 40 دقيقة من إزالة الرباط.
تم فحص طول موقع الحقن من الناحية النسيجية. تم توطين المراسل الفلوري mCherry في الطبقات العميقة من القشرة الأولية وتحت الحمراء. علاوة على ذلك ، أكد تلطيخ خلية مملوءة بالحيوية موقعها ومورفولوجيتها.
تتمثل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول في النقل الدقيق لمنطقة الدماغ الواردة ، والتي يمكن التحقق منها بعد ذلك ، والتشريح السريع للدماغ عند تحضير الشرائح الحادة. يتم دمج هذا الإجراء بسهولة مع وضع العلامات الفلورية لنوع خلية فردي ، مثل فئة فرعية معينة من الخلايا العصبية البينية. لفعل ذلك، سنستخدم حيوانا محورا وراثيا يعبر عن إنزيم إعادة الاتحاد في هذا النوع المحدد من الخلايا.
سمحت التركيبات البصرية الوراثية التي يتم تسليمها فيروسيا بالتقدم السريع في مجالات الأنظمة وعلم الأعصاب الدائرة.
