مرض هنتنغتون، HD، هو مرض غير قابل للشفاء، التنكسية العصبية الناجمة عن طفرة في بروتين هنتنغتين ترميز الجينات. ويرتبط هنتنغتين في المقام الأول مع الحويصلات والبيبولا الدقيقة، وربما تشارك في عمليات النقل التي تعتمد على microtubule. لدراسة تأثير هنتنغتين متحولة على دينامية microtubules، استخدمنا في التصور في الجسم الحي من البروتين EB3، الذي ينظم الخصائص الديناميكية للmicrotubules عن طريق الانحناء وتحقيق الاستقرار في النمو زائد ينتهي.
لتحميل EB3 المسمى الفلوري في الخلايا الليفية للبشرة البشرية ، طبقنا العدوى البلازمية. استخدمنا ثقافة الخلايا الليفية الأولية للحصول على خزعة الجلد للمريض EB3 لهذه الدراسة. قم بتوصيل الخزعة إلى المختبر في غضون ساعات قليلة في المتوسط DMEM ، مع تكملة 15 ميكروغرام لكل ملليلتر من البنسلين ، و 50 وحدة لكل ملليلتر من الستربتومايسين.
ضع أنسجة الخزعة في طبق بيتري طوله ستة سنتيمترات، مع كمية صغيرة من الوسط. باستخدام مشرط معقم، قطع عينة الخزعة إلى قطع حوالي 0.5 إلى ملليمتر واحد في الحجم. ضع واحدا، اثنان، تم الحصول على شظايا في طبق بيتري طوله 3.5 سنتيمتر، وضع زلة غطاء معقم فوق قطع الخزعة.
أضف ببطء 1.5 ملليلتر من وسيط النمو. الألياف الألياف في المتوسط النمو في حاضنة ثاني أكسيد الكربون، في 5٪ CO2 وهذا هو سبعة مئوية، 80٪ الرطوبة. بعد أربعة أو سبعة أيام ، تبدأ الخلايا القرنية الأولى ، ثم تبدأ الخلايا الليفية في الهجرة من الأنسجة إلى أسفل الطبق.
زراعة الخلايا. لتصور transfection، والزجاج أطباق لوحة confocal، ينبغي استخدام أطباق confocal. تغطية أسفل الطبق مع محلول الجيلاتين autoclaved 0.1٪إعدادها في الماء المقطر.
حضانة لمدة 15 دقيقة. إعداد وسيط الثقافة. تخلط جيدا، وتخزين طويل القامة في زائد 4 مئوية.
قم بتدفئة الوسط إلى زائد 37 درجة مئوية، قبل إضافته إلى الخلايا. تقييم الثقافة تحت المجهر. إزالة المتوسطة، وغسل الخلايا مع DPBS معقمة.
إضافة ملليلتر واحد من محلول 0.25٪trypsin قبل الحارة إلى الخلايا. تحقق من الخلايا تحت المجهر إذا كانت تنفصل عن الركيزة تماما. إلغاء تنشيط التريبسين مع ملليلتر واحد من وسيطة الثقافة.
نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. طرد مركزي الأنبوب في 200 G لمدة خمس دقائق. إزالة supernatant، resuspend لوحة الخلايا في ملليلتر واحد من الوسط الثقافة.
عد رقم الخلية. حساب العدد المطلوب من الخلايا. إزالة البذور لهم مع كثافة من ثمانية إلى 15، مضروبا في 10 إلى قوة ثلاثة، مرت بسنتيمتر.
يتم تحريك هذا إلى ملليلترات من وسيط الثقافة. إزالة محلول الجيلاتين من طبق الثقافة المعدة للتلقيح، وإضافة على الفور اثنين من ملليلتر من تعليق الخلية. زراعة الخلايا الليفية في زائد 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.
تحديث المتوسطة كل يومين أو أربعة أيام. للتجارب، استخدم خلايا أربعة أو 11 مقطعا. بحلول وقت العدوى ، يجب ألا يزيد الالتقاء عن 70 ، 80٪ استبدال الوسط الثقافي بواحدة طازجة قبل 24 ساعة من العدوى.
إعداد مجمع الحمض النووي الدهون، استنادا إلى مساحة وكثافة بذر الخلية. تم استخدام عامل العدوى الليبووسومية ، وكثافة بذر الخلية واحد ، مضروبا في 10 إلى قوة أربع خلايا ، مرت بسنتيمتر. أضف ثلاثة ميكرولترات من الكاشف التجاري إلى 125 ميكرولتر من Opti-MEM ، والتي لا تحتوي على مضادات حيوية.
دون لمس جدران الأنبوب، وإعادة الإنفاق بلطف. تمييع الحمض النووي البلازميد، GFP-EB3، إضافة ميكروغرام واحد من الحمض النووي البلازميد إلى 125 ميكرولتر من OptiMEM. إعادة الإنفاق بلطف.
إضافة الحمض النووي البلازميد المخفف إلى كل أنبوب من كاشف العدوى المخفف، نسبة واحدة إلى واحدة. حضانة لمدة 30 دقيقة. أضف مجمع الدهون في الحمض النووي إلى طبق بيتري الذي يبلغ طوله ستة سنتيمترات مع الخلايا.
تخلط مع أرجوحة الصليبية لمدة 30 ثانية. احتضان الخلايا مع عامل العدوى لمدة 24 ساعة، ثم تغيير المتوسطة إلى واحدة جديدة. تحليل الكفاءة بعد التفتيش في 24 و 48 ساعة.
التحضير للتصوير. قبل التصوير الحي للخلايا، قم بتغيير وسيط الثقافة إلى وسط دون صبغة مؤشر PH لتقليل الفلورة الذاتية. تطبيق الزيوت المعدنية بعناية على مرحلة الخلية المتوسطة لتغطية تماما المتوسطة، وعزلها عن البيئة الخارجية للحد من اختراق O2، والتبخر المتوسط.
استخدم مصباح ماكرو وكل الصور في عدسة موضوعية ذات 60 ضعفا و100 مرة مع فتحة أرقام عالية لالتقاط الصورة. بالنسبة للملاحظات viva ، يجب أن يكون المجهر مجهزا وحاضنة للحفاظ على الظروف اللازمة للخلايا ، بما في ذلك ضرب الطاولة البصرية ، والعدسة لتمرير 37 مئوية ، وكانت الغرفة المغلقة هي إمدادات ثاني أكسيد الكربون ، والدعم على مستوى الرطوبة. ضع طبق الكونفوجكال مع الخلايا في حامل المجهر قبل التصوير.
تأكد من أن الطبق والكاميرا متصلان بشكل آمن بحامل الحامل لتجنب الانجراف أثناء التقاط الصور. تعيين معلمات التصوير. اختر قيم التعرض المنخفضة ، لأن الشريحة تحفز على إتلاف الخلايا ، يتفاعل مع مساحات الأكسجين.
لدراسة ديناميات microtubules في الخلايا الليفية الجلد البشري، اخترنا التعرض 300 مللي ثانية. التركيز على الهدف من الاهتمام. لفترة طويلة ، والتصوير الفاصل الزمني ، ونظام تثبيت التركيز التلقائي ، ونظام التركيز المثالي ضروري ، لأنه قد يكون هناك تحول على طول محور المجموعة ، وبالتالي فإن الهدف من الاهتمام سيكون خارج التركيز.
اختر ظروف التصوير المثالية، اعتمادا على حساسية الخلية للضوء، ومعدل تلاشي الكروم المضيئة. وبما أن الهياكل الدقيقة هي هياكل ديناميكية للغاية، فيمكن اختيار وقت قصير إلى حد معقول، ويجب أن يكون معدل الإطار مرتفعا بما فيه الكفاية. للتحقيق في ديناميات microtubule في الخلايا الليفية الجلد، استخدمنا تردد إطار واحد في الثانية الواحدة، لمدة ثلاث أو خمس دقائق.
عند تحديد الكائن التالي للحصول على صورة ، ابتعد عن المنطقة المصورة بالفعل ، نظرا لأنه تحت تأثير الضوء ، هناك نزيف صور قابل للانقضاء. منذ استخدمنا تردد التصوير عالية نسبيا، مصراع الكاميرا لم يغلق بين الصور، وكان المصباح في وقت متأخر عن فترة كاملة من التصوير، والتي تتلاشى زيادة. اختر مقاطع الفيديو المثلى لدراسة ديناميكيات microtubule بصريا ، مع الأخذ في الاعتبار جودة العدوى ، وجودة صور microtubules ، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى ، وعدم الانجراف للخلية المحللة.
استخدم مقاطع الفيديو المختارة لدراسة ديناميكيات microtubules بالإضافة إلى النهايات ، عن طريق ربطها في برنامج فيجي. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي العدوى ، وضمان التعبير عن البروتين الكافي. نسبة جيدة من الإشارة إلى الضوضاء ، لا photobleaching من microtubules ، وعدم وجود خلية الانجراف حاسمة للتصوير.
في التصور في الجسم الحي من ديناميات microtubule يوفر معلومات حيوية عن خصائص هنتنغتين متحولة. يمكن تطبيق بروتوكولنا على دراسات الأمراض الأخرى ، التي ينطوي علم الأمراض على خصائص ديناميكية للهيكل الخلوي.
