يولد هذا البروتوكول نموذجا جديدا لصرع الفص الصدغي حيث أصيبت الفئران بنوبات عفوية ، وكان مفيدا جدا لفحص آليات تكوين الصرع وأيضا لفحص العلاجات الجديدة. يؤدي هذا الإجراء في الفئران VGAT-Cre بشكل موثوق إلى نوبات كهربية ومركبة حركية وحركية متكررة بشكل عفوي دون التسبب في موت خلايا الحصين على نطاق واسع والذي غالبا ما يظهر بعد حالة الصرع التي تنجم عن الاختلالات الكيميائية أو التحفيز الكهربائي المستمر. لبدء صنع سماعات الرأس ، قم بقطع سلك الفولاذ المقاوم للصدأ المطلي بالبولي تترافلوروإيثيلين بطول 3.5 سم وتجريد حوالي ملليمتر واحد من طبقة العزل من طرفي السلك.
ضع دبوسين على حامل نائب ، بحيث يكون الجزء السفلي من الدبوس به شق أطول متجها لأسفل. ثم ، ضع التدفق على الأطراف المجردة من السلك وقمم المسامير. قم بقصدير الجزء المجرد من السلك والجزء العلوي من المسامير بلحام كاف لتغطيته دون أن يفيض على الجانبين.
ضع أحد طرفي السلك المجرد في الدبوس بعمق قدر الإمكان أثناء ذوبان اللحام. كرر العملية للدبوس الثاني مع الطرف الآخر المجرد من السلك. بعد تبريد المسامير واللحام لمدة 10 ثوان ، قم بإزالة المسامير من حامل الرذيلة ثم اسحب المسامير للتأكد من أن الاتصال بين السلك والدبابيس قوي ويثبت.
شطف المسامير في الماء البارد تليها التجفيف. في وقت لاحق ، استخدم مقياس الأومتر للتحقق من التوصيل بين الدبوس الأول والسنون الثاني. اجمع المسامير الموجودة في نهاية السلك معا لتثبيتها بالتوازي والإغلاق.
قم بتثبيت مرقئ في مركز السلك وقم بتدوير المرقئ لتحريف السلك حول نفسه بإحكام. بعد إزالة المرقئ ، قم بتثبيت الملقط على السلك الملتوي على بعد مليمترين أسفل المسامير لثني السلك عند 90 درجة. ادفع السلك 90 درجة للخلف فوق الملقط ، مما أدى إلى انحناء آخر عند ملليمتر واحد من الأول.
استخدم مقصا صغيرا وحادا لقطع السلك الملتوي عند 45 درجة و 3.5 ملم تحت الانحناء. قم بإعداد قطبين كهربائيين ملتويين ثنائي القطب أو مزدوج الدبوس لكل سماعة رأس. لتحضير قطب كهربائي مرجعي واحد ، قم بقطع سلك به دبوس ملحوم على كلا الطرفين إلى قسمين.
ثم اقطع السلك عند سبعة ملليمترات وثني نهاية السلك عند ملليمتر واحد أسفل الطرف. قم بتغطية الطرف المثني الذي يبلغ طوله ملليمترا واحدا من السلك بالملقط وقم بتدوير السلك بإحكام حول الملقط لإنشاء حلقة صغيرة بقطر ملليمتر واحد. بعد ذلك، ثني الملف عموديا على الجزء المستقيم من السلك لجعل طرف السلك يتجه للخارج مرة أخرى.
قم بتجميع جميع الأقطاب الكهربائية في قاعدة التمثال ذات الستة سنون جنبا إلى جنب بمسافة ستة ملليمترات بين القطبين ثنائي القطب. ضع القطب المرجعي في الفتحة الخارجية الوسطى. قبل الشروع في الجراحة ، سجل وزن الفئران VGAT-Cre البالغة من العمر ثمانية أسابيع.
ثم ضع الحيوان في غرفة الحث للحث على التخدير. ضع الماوس المخدر على وسادة تدفئة عند 37 درجة مئوية. في حالة استخدام نظام درجة حرارة يتم التحكم فيه بالتغذية المرتدة ، أدخل مسبار درجة الحرارة في مستقيم الحيوان لمراقبة درجة الحرارة أثناء الجراحة.
لبدء الجراحة ، أعد توجيه تدفق التخدير المستنشق إلى مخروط الأنف وقم بتركيب الحيوان في الإطار التجسيمي عن طريق وضع الأسنان العلوية الأمامية برفق في شريط القاطعة وتحريك المخروط على أنفه. ثم ضع قضبان الأذن في الأذنين وألصقها على الإطار المجسم. تأكد من أن رأس الحيوان مستوي ومتمركز ولا يمكن تحريكه عند فحصه قليلا.
بمجرد تركيب الحيوان ، قم بحقن 0.5 ملليلتر من النورموسول على الفئران للترطيب وتطبيق مواد تشحيم العين لمنع جفاف القرنية. مراقبة عمق التخدير عن طريق معسر مخلب الطرف الخلفي. إذا كان رد الفعل المنسحب غائبا في الحيوان ، فتابع إزالة شعر فروة الرأس للماوس حول المنطقة الجراحية.
عند الانتهاء ، قم بتطهير منطقة الجلد النظيفة ثلاث مرات باستخدام تطبيق متناوب من الإيثانول واليود ، مع الانتهاء من اليود ، وحقن 0.05 ملليلتر من 0.25٪ بوبيفاكايين تحت الجلد. قم بعمل شق في الجمجمة باستخدام مشرط ثم قطع جزء من الجلد بمقص جراحي ، وكشف الجمجمة. ادفع الجلد جانبا قبل تنظيف الجمجمة من جميع الأنسجة الكامنة باستخدام قطعة قطن.
نظف الجمجمة باستخدام بيروكسيد الهيدروجين باستخدام مسحات قطنية معقمة واجعل خيوط الجمجمة والبريجما واللامدا مرئية. باستخدام المثقاب المثبت بشكل مجسم ، انقل طرف المثقاب إلى bregma في إحداثيات صفر X و Y و Z. بعد ذلك ، ارفع المثقاب وانقله إلى لامدا لتحديد إحداثياته لتحديد ما إذا كان الرأس مستويا.
بعد تجفيف الجمجمة جيدا ، ضع قطرة واحدة من لاصق الأسنان ذاتي النقش باستخدام القضيب. انتظر 60 ثانية قبل معالجة لاصق الأسنان بضوء الأشعة فوق البنفسجية للأسنان لمدة 40 ثانية. يشير السطح اللامع إلى أن المادة اللاصقة قد تم ربطها بشكل فعال مع الجمجمة.
بمساعدة مثقاب 0.031 بوصة ، قم بحفر فتحتين للأزيز بعناية بشكل ثنائي في الجمجمة بمعدل 5000 دورة في الدقيقة ، أو دورة في الدقيقة ، وتجنب الحفر في الدماغ. ضع قطرة من المحلول الملحي لتعزيز حفر ثقوب الأزيز. لزرع أقطاب عمق الحصين ، قم بالحفر عند ثلاثة ملليمترات خلفية وثلاثة ملليمترات جانبية من بريجما.
حفر ثقب لدغ واحد للقطب المرجعي فوق المخيخ خلف لامدا في ستة ملليمترات الخلفية وصفر ملليمتر جانبي من بريجما. بعد ذلك ، قم بتركيب قاعدة التمثال ذات الستة سنون مع أقطاب كهربائية مجمعة في حامل القطب على الإطار المجسم. من خلال محاذاة الأقطاب الكهربائية فوق فتحات النتوءات المقابلة ، قم بخفض سماعة الرأس ببطء والتنقل فيها لتحديد موقع طرفي القطب ثنائي القطب أعلى ثقوب نتوءات الحصين اليمنى واليسرى ، وإذا لزم الأمر ، اضبط القطب المرجعي ليحوم فوق الفتحة فوق المخيخ.
عندما تكون أقطاب الحصين الملتوية فوق الثقوب مباشرة ، قم بتصفير المحور Z وقم بخفض القطب ببطء إلى سالب ثلاثة ملليمترات في الحصين الأيمن والأيسر وتوجيه القطب المرجعي إلى الفتحة فوق المخيخ. تحضير الأسمنت الأسنان عن طريق خلط المسحوق والسائل في وعاء الخلط. بعد ذلك ، قم بتغطية سطح الجمجمة والأقطاب الكهربائية والمسافة بين سطح الجمجمة وأسفل القاعدة بأسمنت الأسنان.
بمجرد أن يجف الأسمنت ويتصلب ، افصل حامل القطب عن الذراع المجسمة ، وارفع الذراع ، وأزل الحامل من القاعدة. بعد إعطاء الفأر تحت الجلد باستخدام كيتوبروفين ونورموسول ، قم بإزالة الحيوان من الإطار التجسيمي لنقل الحيوان إلى الوسادة الساخنة في قفص بيت الحيوان. بمجرد الاستيقاظ التام ، أعد الحيوان الوحيد إلى قفص بيت الحيوان ، وأطعم الحيوان بالطعام اللين ، وراقب فقدان الوزن يوميا حتى 72 ساعة بعد الجراحة.
في مخطط الكمان التمثيلي ، يتم عرض عدد المحفزات التي تتطلبها الفئران لمعيار الحالة المشتعلة. وصلت الفئران عادة إلى حالة إشعال النار أو تعرضت لخمس نوبات حركية ثنائية منشطة رمعية بعد 15 عملية تحفيز. تم العثور على الكمون للنوبات المتكررة التلقائية ، أو SRS ، ليكون 10.7 ، وكان متوسط تواتر النوبات 1.3 نوبة في اليوم.
أظهر توزيع SRS الموثوق به أن الفئران كانت مصابة بالصرع لمدة 23 يوما تقريبا. في الصور التمثيلية ، يمكن رؤية عدد الخلايا العصبية الإيجابية المضادة ل NeuN أو الوفيات العصبية في الحقول الفرعية المختلفة للحصين والقشرة المخية الداخلية. من المهم أن يدخل القطبان ثنائي القطب بسلاسة إلى فتحتي النتوءات ، لذلك يجب أن يكونا فوق فتحات الأزيز مباشرة.
وأيضا ، من المهم تطبيق الأسمنت السني بعناية وتركه يتصلب تماما قبل إزالة حامل القطب. تسمح لنا هذه التقنية بتوليد فئران مصابة بالصرع ومراقبتها باستمرار من خلال تسجيل EEG وكذلك تسجيل الفيديو في وقت واحد. ومن خلال التجارب التي نقوم بها ، يمكننا بعد ذلك اختبار استراتيجيات علاجية جديدة مثل العلاج الجيني لتقليل تكرار ومدة وشدة النوبات.
