وسوف يكون من بين الذين سيبرهنون على هذا الاجراء طالب الدراسات العليا تشى تشانغ ، واخصائى الابحاث نانان تشانغ ، والاساتذة ايلكر اوزدن ، وشينغهوا دينغ . الهدف العام لهذا الإجراء هو تطوير نوع الخلية الخلايا الفلكية زوج محدد والخلايا العصبية وطريقة استهداف الميتوكوندريا في المختبر وفي عدد الميتوكوندريا في الجسم الحي من التصوير باستخدام مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا, GCaMP5G و 6s. للتصوير في المختبر أو في الجسم الحي، سنقوم ببناء بلازميدات الحمض النووي التي تحتوي على الخلايا الفلكية أو الخلايا العصبية المروجين محددة gfaABC1D أو CaMKII ومؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا، GCaMP5G/6s مع تسلسل استهداف الميتوكوندريا.
لتصوير الكالسيوم الميتوكوندريا في المختبر نحن الخلايا العصبية الخلايا العصبية المصابة المستزرعة على زلات الغطاء الزجاجي مع البلازميدات الحمض النووي المذكورة أعلاه باستخدام طريقة ليبوكوثامين. يمكن بدء التصوير بعد يوم إلى يومين من العدوى عن طريق نقل الغطاء الزجاجي إلى غرفة الوفرة تحت المجهر الفلوري أو اثنين من فوتون. فيما يلي أمثلة على إشارات الفلورسنت من الميتوكوندريا والخلايا الفلكية التي تعبر عن GCaMP6s على اليسار ، وبالنسبة للميتوكوندريا في الخلايا العصبية ، والتعبير عن GCaMP5G على اليمين.
للتصوير في الجسم الحي، أعددنا الفيروس الغدي المرتبط بالنمط المصلي 5 للتعبير عن mito-GCaMP5G في الخلايا الفلكية والنمط المصلي 9 المرتبط بالفيروس الغدي للتعبير عن mito-GCaMP6s في الخلايا العصبية. لإجراء جراحات حقن الفيروسات المجسمة، قمنا أولا بتخدير الماوس بنسبة 3٪ isoflurane. في وقت لاحق أثناء الجراحة ، يتم تقليل مستويات isoflurane إلى 2٪ بعد الوصول إلى المستوى المناسب من التخدير ، وحلق الشعر فوق فروة الرأس ووضع الماوس على أداة جراحية ستيريوتاك.
يتم تطبيق مرهم العيون على العينين لحمايتهما أثناء الجراحة. يتم إجراء جراحات الحقن باستخدام إجراءات مطهرة، بما في ذلك الأدوات العقيمة والتقنيات العقيمة. يتم تعقيم الأدوات الجراحية إما عن طريق الالاستعباد التلقائي أو عن طريق معقم حبة ساخنة.
بعد تركيب الماوس على الضريبة المجسمة ، يتم تنظيف فروة الرأس مع بيتادين و 70٪ إيثانول ثلاث مرات. ثم يتم قطع الجلد مفتوحة على طول محور لامبدا Bregma ويتم عمودي من خلال حفر عالية السرعة على الموقع المستهدف. في هذا العمل، استهدفنا إما قشرة المحرك أو القشرة الرأسية.
يتم إدخال حقنة هاملتون قياس 33 تحمل ناقلات الفيروس الغدي المرتبطة بها من خلال ثقب في الدماغ ويتم حقن ناقلات في المنطقة المستهدفة. للتسليم القشري، ونحن حقن محلول الفيروس في عمقين في خطوات متعددة. أولا، نقوم بإدخال الإبرة بعمق ملليمتر واحد في القشرة.
بعد السماح لخمس دقائق للدماغ للتعافي، ونحن نقل الإبرة تصل إلى عمق 700 ميكرومتر، وحقن 500 لتر نانو من محلول الفيروس. بعد الانتهاء من الحقن، ونحن ننتظر لمدة خمس دقائق للسماح للفيروس لنشر في الدماغ. ثم ننقل الإبرة إلى موقع الحقن الثاني بعمق 300 ميكرومتر.
هنا، نحن حقن آخر 500 نانو لتر من محلول الفيروس. بعد الانتهاء من الحقن، ونحن ننتظر لمدة 10 دقائق للسماح للفيروس لنشر ومن ثم نقوم بإزالة الإبرة من الدماغ وإغلاق ثقب بور مع الشمع العظام أو كويك سيل. وأخيرا، يتم خياطة الجلد مع Vetbond ويتم استرداد الماوس على وسادة التدفئة قبل إرسالها مرة أخرى إلى منشأة الحيوان.
سيكون الماوس جاهزا للاستخدام في التصوير الحي في غضون ثلاثة أسابيع على الأقل ، وهو الإطار الزمني الذي ينضج فيه تعبير GCaMP. كما تتم جراحات زرع نافذة الجمجمة باستخدام الحالات العقيمة كما هو موضح في جراحات الحقن. العمليات الجراحية نافذة الجمجمة متطابقة مع العمليات الجراحية الحقن حتى نقطة التعرض الجمجمة.
وبمجرد الكشف عن الجمجمة، يتم وضع علامة على أرباع قطرها 2-3 ملم من القحف فوق المنطقة التي حقنها الفيروس بأربعة ثقوب ضحلة مصنوعة من مثقاب عالي السرعة متصل بجهاز تلاعب. ثم يتم تخفيف الجزء من الجمجمة ، في الخوانق من فغر القحف عن طريق حفر العظام بعناية وببطء في دائرة ، وربط هذه الثقوب الأربعة. بمجرد أن تكون الجمجمة على الحدود رقيقة بما فيه الكفاية ، يتم رفع العظام بملاقط حادة وإزالتها.
يمكن إزالة طرة ماتر المكشوفة أو الاحتفاظ بها سليمة لزرع نافذة الجمجمة. تتكون نافذتنا القحفية من زلة غطاء زجاجي قطرها 3-5 ملليمترات ، مما يخلق قرص سيليكون سمكه حوالي 300 ميكرون في المركز. يتم إنجاز تركيب نافذة الجمجمة عن طريق وضعها فوق فغر القحف.
يتم استخدام قطعة من المسواك تعلق على المتلاعب لدفع نافذة الجمجمة بلطف على سطح الدماغ. ثم، يتم إغلاق حافة النافذة القحفية مع كمية صغيرة من لاصقة السيليكون كويك سيل. وأخيرا، يتم إصلاح نافذة الجمجمة في حواف الجمجمة مع الاكريليك الأسنان.
وينبغي إيلاء الرعاية لتطبيق الاكريليك الأسنان قليلا على حواف النافذة القحفية لارتباط قوي. كما نفذت العديد من مجموعات البحوث الأخرى في الماضي، يمكن استخدام هلام agarose 1.2٪ بين الزجاج الغطاء والدماغ كبديل لقرص السيليكون. بعد تثبيت نافذة الجمجمة بشكل آمن ، يتم إرفاق لوحة معدنية بالجمجمة.
سيتم استخدام لوحة الرأس هذه لتحديد رأس الماوس على خشبة مسرح مجهر فوتونين أثناء جلسات التصوير. يمكن الحصول على امتصاص الكالسيوم الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية عن طريق تطبيق ATD في حين يمكن الحصول على امتصاص الكالسيوم الميتوكوندريا في الخلايا العصبية عن طريق تطبيق الجلايسين الغلوتامات في السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي ، مع الجاذبية من خلال نظام التخثر. امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا الفردية في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية ويمكن بعد ذلك أن يلاحظ.
تظهر الأفلام التالية امتصاص الكالسيوم الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية التي أثارها ATP على اليسار وفي الخلايا العصبية التي أثارها الغلوتامات والجليسين على اليمين. يتم التصوير عن طريق جمع صور منفوقة زمنيا في الجسم الحي من فوتونين للإشارات الفلورية الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية مع نظام المجهر ألتيما اثنين الفوتون من تقنيات المرج، والتي تم تجهيزها مع مليون تي الياقوت الترا ليزر واحد من متماسك. نحن نستخدم أطوال موجية من 880 إلى 910 نانومتر ، والتي هي الأمثل للتصوير في الجسم الحي مع GCaMP5G و 6s.
الخلايا الفلكية والتعبير عن الخلايا العصبية محددة من mito-GCaMP5G و 6S وإعادة تأكيدها من خلال توطين مشترك من العلامات الخاصة astrocyte من SR101 أو علامة الخلايا العصبية محددة NeuN. يمكن ملاحظة امتصاص الكالسيوم الميتوكوندريا التلقائي في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية في الجسم الحي عن طريق التصوير الفاصل الزمني باستخدام المجهر ثنائي الفوتون. تظهر الصور زيادات تلقائية في الكالسيوم في الميتوكوندريا الفردية في الخلايا الفلكية على اليسار وخلية عصبية على اليمين.
نهجنا مفيدة لنوع الخلية محددة تصوير الكالسيوم الميتوكوندريا في المختبر وفي الجسم الحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير امتصاص الكالسيوم الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية وفي الخلايا العصبية.
