يجعل طحن FIB المترابط 3D أحداثا خلوية محددة وحتى نادرة في متناول Cryo-TEM. السماح بالكشف عن البنية الفائقة لهذا الحدث مباشرة داخل البيئة الأصلية. يعمل سير العمل المترابط على تحسين معدل نجاح استهداف الهياكل الخلوية النادرة ، ويساعد على تحديدها بشكل لا لبس فيه في البيئة الخلوية المزدحمة.
سيتم توضيح الإجراء من قبل آنا بيبر وكريستينا كابيتانيو ، الخبيرين في التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. ابدأ الفحص المجهري الفلوري بالتبريد للشبكات المصنفة بالخلايا من خلال الحصول على نظرة عامة ميدانية واسعة في الوضع الفلوري والمنعكس. ثم حدد مربعات الشبكة المناسبة مع إشارة مضان.
بعد التأكد من توزيع الخلايا والخرز بالتساوي نحو مركز كل مربع ، اختر المربعات على 200 شبكة شبكية يمكن الوصول إليها بواسطة كل من أداة FIB-SEM و TEM ، وهي على بعد ثلاثة مربعات على الأقل من حافة الشبكة. في كل مربع من مربعات الشبكة المحددة ، احصل على مكدس فلورسنت بخطوة مركزة مناسبة. يجب استخدام أهداف الفتحة العددية العالية لزيادة عدد الفوتونات ودقة التوطين.
على مجهر متحد البؤر مع فتحة عددية 0.9 هدف ، احصل على مكدسات بحجم خطوة 300 نانومتر وأخذ عينات زائدة من قيمة Nyquist. سجل مكدسات ألوان متعددة وقم بتخزين الشبكات تحت النيتروجين السائل حتى الاستخدام مرة أخرى. استخدم إما علامات القطع أو التوجيه لضمان التوجيه الصحيح للشبكة لوضعها لاحقا في TEM.
قم بتحميل الشبكات في أداة التبريد FIB-SEM. تأكد من أن اتجاه الطحن عمودي على محور إمالة TEM. لطلاء الشبكات بطبقة عضوية معدنية واقية ، استخدم جهاز تشفير البلازما ونظام حقن الغاز في مواضع المرحلة المحددة مسبقا بواسطة إعداد FIB-SEM.
بعد ذلك ، قم بتسجيل نظرة عامة على شبكة SEM وقم بإجراء ارتباط 2D مع لمحات عامة عن FLM. ابحث عن مربعات الشبكة عن طريق فحص لمحات عامة عن الشبكة المسجلة يدويا أو باستخدام حزمة برامج. حدد وضع علامة على أربعة مواضع مقابلة للمربعات في نظرة عامة على شبكة FLM و SEM واحسب التحويل بين النقاط المحددة لارتباط FLM-SEM.
بعد ذلك ، ضع العلامات في وسط مربعات الشبكة المقابلة التي تم الحصول على مكدسات FLM لها قبل التنبؤ بموضعها في عرض SEM. لكل مربع شبكة مترابط ، التقط صورة شعاع أيوني منخفض التيار بزاوية طحن FIB المختارة وحدد مجال رؤية بالموضع المطلوب والتكبير الذي يطابق بيانات التألق. بالنسبة ل 200 شبكة شبكية ، احصل على بيانات FIB-SEM لاحتواء مربعات الشبكة الفردية ، بما في ذلك أشرطة الشبكة.
بعد ذلك ، التقط صورة SEM لنفس المربع للمساعدة في تحديد الخرزات المقابلة في عرض التألق والحزمة الأيونية. قم بإجراء تسجيل مكدس 3D FLM الخام أو غير المفكك وعرض شعاع الأيونات 2D لكل موضع باستخدام صندوق أدوات الارتباط ثلاثي الأبعاد ، 3D CT ، عن طريق تحميل مكدس 3D FLM المعاد تقطيعه وعرض شعاع الأيونات في 3D CT.In بيانات التألق ، حدد أربع حبات إيمانية وانقر بزر الماوس الأيمن على قائمة المواضع لتحديد موضع 3D للخرز عبر التركيب الغاوسي للإشارة في X ، Y و Z.ثم ، حدد الخرزات المقابلة في صورة شعاع الأيونات لإجراء ارتباط 3D الأولي. وبالمثل ، أضف المزيد من الخرز إلى التسجيل للتحقق من دقة الارتباط.
اترك بعض الخرزات الإيمانية التي يمكن التعرف عليها بوضوح في كل من التألق والشعاع الأيوني عن طريق التحقق من موقعها المتوقع مقابل الموقع الفعلي في صورة الحزمة الأيونية. في 3D CT ، يمكن عرض جذر متوسط مربع الخطأ "أو قيم RMSE ، لتقييم اتساق الارتباط. تأكد من أن قيم RMSE صغيرة وبترتيب دقة الترجمة.
بعد ذلك ، حدد الإشارات الخلوية المستهدفة وتناسب موضع 3D في مكدس FLM قبل تطبيق التحويل للتنبؤ بالمواضع المستهدفة في عرض الحزمة الأيونية. لكل مربع مرتبط ، قم بنقل المواضع المتوقعة للميزات ذات الأهمية إلى أداة FIB-SEM لوضع أنماط طحن الصفيحة. إذا كانت هناك إشارات متعددة لكل خلية ، فضع الأنماط لتضمين أقصى نقاط اهتمام ممكنة في نفس الصفيحة.
مطحنة خشنة الصفائح تليها طحن دقيق للحصول على سمك نهائي من 150 إلى 250 نانومتر. تأكد من أن اتجاه الصفيحة عمودي على محور الميل عند تحميل الشبكات في المجهر الإلكتروني المرسل. احصل على مونتاج شبكي ولمحات عامة لكل مربع شبكي يحتوي على صفائح مع تكبير مناسب ووقت تعرض لتصور الحبيبات الإيمانية في صور TEM دون إضافة جرعة إلكترونية إجمالية بشكل كبير.
احصل على خرائط TEM عالية الدقة لكل صفيحة. يربط التسجيل و 3D-2D مكدس FLM بمربع شبكة TEM ولمحات عامة عن الصفيحة في 3D CT. إجراء الارتباط بين FLM و TEM من التكبير المنخفض إلى العالي في TEM. بعد نقل المواضع ، قم بإعداد وتشغيل سلسلة الميل في المواضع المترابطة "ثم استخدم التكبير المناسب وإلغاء التركيز والجرعة الإجمالية لبدء التقاط الصورة عند الإمالة المسبقة التي تحددها الصفيحة باستخدام مخطط إمالة متماثل للجرعة.
اتبع إما الحصول اليدوي أو الدفعي للصور. في التحليل التمثيلي ، تظهر نظرة عامة على TEM ذات التكبير المنخفض لموقع الطحن لتوطين السمات البيولوجية ذات الأهمية. في وقت لاحق ، تم ربط عرض تكبير أعلى مع إسقاط الكثافة القصوى FLM وتم إعداد مواقع للحصول على التصوير المقطعي.
في الصور المكتسبة ، يمكن تصور رواسب البروتين الداخلي في بيئتها الأصلية. تحسين العينة مهم جدا. يجب تحسين إعداد الشبكة للحصول على توزيع جيد للخلايا للطحن وعدد جيد من الخرز الائتماني المرئي في معظم مربعات الشبكة.
ساعد الطحن المترابط 3D في الكشف عن البنية الفائقة للعمليات الخلوية المختلفة مثل التقدم التدريجي للالتهام الذاتي في كل خلية ، ويستخدم لالتقاط حجرة منفصلة عن طور جديد.
