يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وسريعة لقياس وظيفة الميتوكوندريا الورم. ينطبق البروتوكول على نطاق واسع على الأورام الترجمية السريرية ، وسيساعد على تعزيز التفسير التشخيصي والميكاني لدور الميتوكوندريا في بداية السرطان وتطوره. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تطبيق تجانس الأنسجة لتبسيط التحضير وزيادة غلة الميتوكوندريا مع تخفيف قيود الانتشار.
تقدم هذه التقنية تطبيقات محتملة في البيئات السريرية والتشخيصية مع تقييم كمي لوظيفة الميتوكوندريا السرطانية باستخدام أنسجة الورم المحزوصة حديثا أو المقتطعة. ابدأ بوضع متجانس زجاجي يحتوي على ملليلتر واحد من متوسط تنفس الميتوكوندريا ، أو MiR05 ، في حشرات زجاجية مناسبة بإحكام على الجليد الرطب. ضع الأنسجة في ملليلتر واحد من محلول الحفاظ على الخزعة ، أو BIOPS ، في طبق بيتري بارد الجليد.
قطع الورم إلى قطع صغيرة من حوالي 5 إلى 10 ملليغرام لكل منهما، ووضع قطع الورم المتبقية مرة أخرى إلى 10 ملليلتر من BIOPS أبقى على الجليد. بعد النشاف أقسام الأنسجة بعناية على ورقة تصفية، ووضعها على قارب وزن البلاستيك الصغيرة القطران وتسجيل الوزن الرطب الأولي. ضع القطع غير المستخدمة مرة أخرى في أنبوب مخروطي 10 ملليلتر من BIOPS للحفاظ المستمر.
غمر أقسام الأنسجة في متجانس الجليد الباردة التي تحتوي على MiR05 وتسجيل الوزن المتبقي على قارب الوزن. باستخدام حشرات زجاجية مع مجموعة إزالة من 0.09 إلى 0.16 ملليمتر، وتعطيل بلطف أنسجة الورم عن طريق الانتهاء من خمسة إلى سبعة أسفل وحتى السكتات الدماغية. لكل ضربة ، قم بتدوير الحشرات في حركة اتجاه عقارب الساعة / عكس عقارب الساعة ثلاث مرات أثناء دفع الحشرات لأسفل ، وثلاث مرات إضافية أثناء سحب الحشرات مرة أخرى.
السماح للأنسجة لتسوية إلى الجزء السفلي من المتجانس في ما بين السكتات الدماغية، ولكن تجنب جلب الحشرات تماما فوق حجم السوائل لمنع رغوة. صب المتجانسة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر ووضعه على الجليد. ماصة واحدة إلى ثلاث ملليلترات من MiR05 الطازجة على الحشرات وإلى المتجانس لغسل أي تجانس الأنسجة المتبقية.
صب غسل MiR05 في أنبوب مخروطي يحتوي على متجانسة. كرر هذه الخطوة مرتين إلى ثلاث مرات لضمان النقل الكامل للمتجانس. لحساب تركيز الأنسجة المتجانس بدقة، قم بفحص المتجانس والتجانس بعناية للمواد غير المتجانسة المتبقية، والتي تشمل النسيج الضام.
لإزالة المواد غير المتجانسة من المتجانس التي لا يمكن الوصول إليها مع ملاقط، بعد إضافة MiR05 إلى المتجانس، يستنشق حجم، بما في ذلك الأنسجة، مع ماصة ونقل محتويات إلى طبق بيتري. إزالة المواد غير متجانسة استقر في قطع كبيرة في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي من التجانس عن طريق التجسس عليها مع ماصة، ووضعها على غطاء الأنبوب المخروطي. إزالة الأنسجة من طبق بيتري أو غطاء أنبوب مخروطي مع ملاقط، ولطخة على ورق التصفية.
إضافة المتجانس المتبقية من غطاء أنبوب مخروطي مرة أخرى إلى أنبوب مخروطي. قم بسقف الأنبوب، ثم عكسه لخلطه. أعد فحص المتجانسات والتجانس لأي مواد إضافية غير متجانسة، وكرر الخطوات لإزالة المواد غير المتجانسة إذا لزم الأمر.
وزن وتسجيل كتلة المواد غير المتجانسة التي تم استردادها من المتجانس. فحص إعداد متجانسة لأي الأنسجة سليمة بشكل صارخ نقل، وإزالة القطع غير متجانسة وتزن حسب الضرورة. طرح وزن الأنسجة تعافى من وزن القارب، التجانس، ومتجانسة من الوزن الرطب الأولي لحساب وزن العينة النهائية.
باستخدام وزن العينة النهائي، أضف MiR05 إضافية لتحقيق التجانس إلى التركيز المطلوب. بمجرد وزن المتجانس وإعداده ، انتقل إلى الفحص في أقرب وقت ممكن. احتفظ بالعينة المخزنة على الثلج الرطب حتى يتم نقلها إلى الجهاز.
بمجرد معايرة الجهاز وإعداد العينة ، قم بإزالة سدادات الحركة الملتوية وتوبيخ MiR05 من الغرف ، وتجنب الغشاء المكشوف داخل الغرفة. خلط جيدا متجانسة، وإضافة 2.25 ملليلتر من المتجانسة إلى الغرفة. لنفترض أنه يتم إضافة متجانس واحد إلى غرف متعددة ، ماصة ملليلتر واحد من المتجانسة في كل مرة في كل غرفة مع خلط المتجانس لضمان توزيع الأنسجة على قدم المساواة.
انقر على F4 لتسمية الحدث واختامه الزمني، ثم انقر فوق موافق. ملء حقنة 50 ملليلتر مع الأكسجين من خزان الأكسجين مع المنظم وأنابيب الغاز باستخدام إبرة حادة قياس 18. حقن الأكسجين مباشرة في الغرف لhyperoxygenate لهم ما يقرب من 500 ميكرومولار الأكسجين.
أدخل سدادات فضفاضة وانتظر لإغلاق حتى يصل الأكسجين إلى ما يقرب من 480 ميكرومولار. مع حركة التواء، وإغلاق الغرفة ببطء والسماح للتنفس إلى التوازن لمدة 15 إلى 20 دقيقة تقريبا. ملء الشعيرات الدموية المركزية سدادة مع MiR05 إذا لزم الأمر.
استخدام microsyringes مخصصة لحقن الركائز، uncouplers، ومثبطات في غرف مغلقة تماما لتسمية وزمن الأحداث لكل غرفة في الوقت الحقيقي. حدد F6 لضبط تركيز الأكسجين والمقاييس السلبية المنحدر الأكسجين حسب الحاجة. بعد كل حقنة، اغسل الحقنة ثلاث مرات في الماء للمركبات القابلة للذوبان في الماء، و70٪ إيثانول للمركبات المذابة بالإيثانول.
إضافة خمسة ميكرولتر من مالات 0.8-المولار والمضي قدما على الفور إلى الحقن المقبل. غسل حقنة الحقن ثلاث مرات في الماء. إضافة خمسة ميكرولترات على الفور من 1-مولار بيروفاتي، وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار.
بعد غسل الحقنة، أضف 10 ميكرولترات من 0.5 مولار ADP وانتظر استجابة ADP لتحقيق الاستقرار. غسل الحقنة وإضافة خمسة ميكرولتر من الغلوتامات 2-الضرس وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار. غسل المحاقن، ثم إضافة خمسة ميكرولترات من السيتوكروم-C 4-ملليمولار، وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار.
بعد غسل المحقنة، أضف 20 ميكرولتر من السجانات المولية وانتظر حتى يستقر التنفس. Titrate 0.5-إلى 1-microliter زيادات من 1-ملليمولار FCCP وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار بعد كل حقنة. استمر حتى لا تكون هناك زيادة إضافية في التنفس.
غسل حقنة الحقن ثلاث مرات في الإيثانول 70٪. إضافة اثنين من microliters من rotenone 150 ميكرومولار وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار. إضافة ميكرولتر واحد آخر من rotenone لضمان عدم وجود مزيد من تثبيط.
إذا كان هناك انخفاض في التنفس، والاستمرار مع حقن إضافية حتى لا يكون هناك انخفاض في التنفس، ثم غسل حقنة الحقن ثلاث مرات في الإيثانول 70٪. إضافة اثنين من microliters من 125 ميكرومولار antimycin A وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار. إضافة ميكرولتر واحد آخر من antimycin A لضمان عدم وجود مزيد من تثبيط.
إذا كان هناك انخفاض في التنفس، والاستمرار مع حقن إضافية حتى لا يكون هناك انخفاض في التنفس. غسل المحاقن ثلاث مرات مع 70٪ الإيثانول. تحقق من تركيز الأكسجين في الغرفة.
إذا كان التركيز أقل من 125 ميكرومولار، إعادة أكسجينات إلى هواء الغرفة، أو hyperoxygenate أقل ما يقال لضمان أن الأكسجين لا يحد من تدفق الجهاز التنفسي. إضافة خمسة ميكرولتر من الأسكوربات 0.8-المول. غسل الحقنة ثلاث مرات في الإيثانول 70٪.
إضافة فورا 10 ميكرولتر من TMPD 0.2-الضرس، وانتظر زيادة في التنفس. بعد غسل المحاقن بالإيثانول، أضف 25 ميكرولتر من أزايد الصوديوم 4-الأضراس على الفور عندما تدفق الجهاز التنفسي من الهضاب TMPD ascorbate. إنهاء بالنقر فوق ملف وحفظ وقطع الاتصال.
ولوحظ أن 40 ملليغرام لكل ملليلتر من الأنسجة المتجانسة أدت إلى استنفاد الأكسجين بسرعة. تباطأ استهلاك الأكسجين بشكل كبير مع 30 و 20 ملليغرام لكل ملليلتر من تجانس الأنسجة ، لكنه انخفض بسرعة في وقت قصير في غياب الركائز أو ADP. 10 ملليغرام لكل تركيز ملليلتر من الأنسجة المتجانسة أدى إلى معدل استهلاك الأكسجين الأمثل.
وقد استخدم بروتوكول SUIT لتقييم الفوسفور التأكسدي ونقل الإلكترون المرتبطين ب NADH و succinate، فضلا عن نشاط المركب الرابع. تم تقييم إطلاق السيتوكروم C في وجود بيروفاتي وماليت ، أو succinate و rotenone ، وكلاهما كشف أن إعداد متجانسة لم تلحق الضرر الميتوكوندريا. كما وجد أن الفوسفور التأكسدي المرتبط ب NADH كان ضئيلا في أورام EO771.
كشف المعايرة من FCCP لدفع تدفق الإلكترون الأقصى أنه في أورام EO771 ، كان الفوسفور ، بدلا من الأكسدة ، يقتصر على التنفس. كانت ملامح الورم التنفسية المتجانسة مماثلة لتلك الموجودة في خلايا EO771 غير المزروعة ، digitonin permeabilized ، باستثناء نقل الإلكترون الأقصى المتناقص المدعوم بركائز مرتبطة ب N و S في الورم. تم تقييم الحركية التنفسية للسجينات بشكل أكبر من خلال المعايرة التدريجية لشرطة أبوظبي الفرعية حتى يتم تحقيق المعدل الأقصى.
وكان تركيز نصف الحد الأقصى من ADP في وجود succinate وروتينون 37.5 ميكرومولار، في حين أن المعدل الأقصى كان حوالي 10.5 picomoles في الثانية الواحدة، لكل ملليغرام. وتكتنط الأدوات التي أنشئت في مجال الرعاية الروتينية، فضلا عن مناولة الأنسجة، بأهمية حاسمة لنجاح هذه التجارب. 10- ويمكن اتباع هذه الإجراءات، على أساس مسألة الاهتمام، باتباع نهج أخرى خاصة بالكتلة أو العلامات لتحديد معدل التطبيع.
وتشمل التدابير الشائعة تحديد كمي للبروتين والنشاط الأنزيمي لمنثوات سيترات، ولكنها تختلف استنادا إلى النظام النموذجي والتصميم الإحصائي والسؤال البحثي.
