طريقة الغطس اليدوي الموصوفة هنا هي طريقة فعالة من حيث التكلفة وموثوقة لإعداد عينات للفحص المجهري للإلكترون ناقل الحركة. في هذا الفيديو، سوف نبين كيفية إعداد المكبس اليدوي، وإعداد cryogen، وأداء النشاف اليدوي والغطس من شبكات EM. إعداد بيئة الهبوط اليدوي.
يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء في غرفة باردة يتم الحفاظ عليها عند 40 درجة مئوية مع رطوبة أكبر من 95٪نوصي باستخدام المواد المعروضة هنا وكما هو موضح في البروتوكول عبر الإنترنت للنشاف اليدوي والغطس. إعداد ديوار cryogen والغطاس اليدوي. لتجميع ديوار cryogen، أولا تثبيت قاعدة منصة في الجزء السفلي من ديوار الستايروفوم الأزرق، وضمان أنها مسطحة ومستوى.
ثم ضع حامل سفينة الإيثان على قمة قاعدة المنصة وأدخل وعاء الإيثان النحاسي. وأخيرا، وضع منصة تخزين شبكة الغزل. بعد ذلك ، حدد موقع ديوار يغرق إلى قاعدة المكبس اليدوي.
مركز سفينة الإيثان تحت الذراع يغرق وتأمين ديوار يغرق إلى القاعدة. لضبط ارتفاع الغطس اليدوي ، قم أولا بإرفاق شريط جديد بقاعدة الذراع المنغمسة. بعد ذلك ، قم بتثبيت زوج من ملاقط اللقط عن طريق لف الشريط بأمان حول الذراع المنغمسة وقاعدة الملاقط.
تأكد من أن الملاقط متصلة بقوة عن طريق النقر عليها بخفة. عقد الذراع يغرق وخفض ببطء ملاقط في وعاء الإيثان النحاس عن طريق الاكتئاب دواسة القدم. ضبط موقع ديوار يغرق بحيث الملاقط تحديد موقع إلى منتصف سفينة الإيثان النحاس.
نصائح من ملاقط لا ينبغي الاتصال حجم أو أسفل السفينة الإيثان النحاس لتجنب الأضرار التي لحقت ملاقط ومغطاس يدوي. بمجرد تعيين الموضع، أعد تعيين ذراع الغطس اليدوي. إعداد Cryogen.
يجب إجراء إعداد Cryogen في غرفة جيدة التهوية ويجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة في جميع الأوقات. للبدء، ضعف النيتروجين السائل مباشرة في ديوار يغرق، ووقف عندما يصل مستوى النيتروجين السائل الجزء العلوي من وعاء الإيثان النحاس. يجب أن يكون النظام باردا بما يكفي للمضي قدما بعد توقف النيتروجين السائل عن الفقاعات بعنف.
سيستغرق هذا حوالي خمس دقائق. يأتي الإيثان كغاز مضغوط ويحتاج إلى تكثيف. لضبط تدفق الغاز لتكثيف الإيثان الأمثل، أدخل طرف خط غاز الإيثان في كوب من الماء طوله 250 مليون دولار ومراقبة الفقاعات.
يجب أن ينتج تدفق الغاز تيارا ثابتا من الفقاعات التي لا تعطل سطح الماء بعنف. للبدء في تكثيف الإيثان، ضع طرف خط غاز الإيثان في الجزء السفلي من سفينة الإيثان النحاسية. تحريك ببطء طرف معدني والبدء في تسييل الإيثان.
بمجرد أن يبدأ الإيثان في البرودة، سوف يصدر ضوضاء مسموعة. ملء السفينة الإيثان النحاس إلى ثلاثة أرباع كامل من الإيثان السائل. أعلى قبالة ديوار يغرق مع النيتروجين السائل، وضمان أنه يمس سفينة الإيثان النحاسية ولكن لا تسرب في ذلك.
إضافة النيتروجين السائل ضروري لتجميد الإيثان موحدة. وضع غطاء الرغوة على ديوار الأزرق يغرق، والسماح للثان لترسيخ تماما. إعادة تشغيل تدفق غاز الإيثان ووضع بعناية غيض من خط الغاز في الإيثان الصلبة.
من المهم وضع الطرف عموديا في السفينة والاستغناء عن الإيثان في الجزء السفلي. يحرك الطرف المعدني ببطء لإذابة الإيثان وإحضار مستوى الإيثان السائل إلى أعلى السفينة. أغلق الغطاء لمدة دقيقة واحدة تقريبا واسمح للإيثان بترسيخ حواف السفينة النحاسية حتى يظهر ما بين ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات من الإيثان الصلب.
الإيثان الآن في درجة حرارة مثالية لتجميد العينات البيولوجية. إرفاق ديوار يغرق بعناية إلى قاعدة المكبس اليدوي. ربط زوج من ملاقط لقط عن طريق التفاف الشريط بأمان حول الذراع يغرق وقاعدة ملاقط.
عقد الذراع يغرق وخفض ببطء ملاقط في الإيثان السائل عن طريق الاكتئاب دواسة القدم. ضبط موقع ديوار يغرق بحيث الملاقط تحديد موقع إلى منتصف الإيثان السائل، وتجنب الاتصال مع حلقة الإيثان الصلبة. إعداد المواد والملحقات يغرق.
إعداد ورقة النشاف عن طريق قطع كل ورقة تصفية دائرية إلى شرائح عرضها سنتيمتر واحد تقريبا. تجنب لمس مركز ورقة النشاف وتجاهل القطع الصغيرة. من المهم التأكد من أن شرائط الورق النشاف جافة ونظيفة وخالية من الملوثات.
قبل الغطس، ضع صناديق الشبكة في ديوار يغرق في فتحات المناسبة. تأكد من أن الشبكة تغطي مجانا لتدوير. إعداد عينات CryoEM عن طريق يغرق تجميد.
نظرا لتنوع الشبكة والشبكة الاستعدادات ، اتبع البروتوكولات الموصى بها لجعل الشبكات هيدروفيلي. للتعامل مع الشبكات بشكل صحيح، استخدم ملاقط لقط نظيفة وجافة لالتقاط الشبكات المائية في الحلقة الخارجية. قم بتمرير المشبك البلاستيكي لتأمين الشبكة واضغط على الملاقط برفق لضمان تثبيت الشبكة بشكل صحيح.
تطبيق ثلاثة ميكرولترات من العينة إلى الجزء الأمامي من الشبكة التي عقدت في ملاقط لقط. إرفاق ملاقط بحزم إلى الذراع اليدوي يغرق عن طريق التفاف الشريط حول قاعدة ملاقط. العينة جاهزة الآن ليتم مسحها وتجميدها.
عقد كل طرف من شريط نظيف من ورق النشاف بين أصابع السبابة والإبهام. بقية يديك على حافة ديوار يغرق لإنشاء موقف مستقر. يجب أن يكون ورق النشاف على بعد سنتيمتر واحد تقريبا من سطح الشبكة.
ثني ورقة النشاف حتى يتصل المركز بالشبكة. من المهم أن تكون ورقة النشاف موازية لسطح الشبكة للسماح حتى بالاتصال ومنع تلف الشبكة. عندما تتوقف الجبهة السائلة المتنقلة عن الانتشار، ابدأ العد.
لطخ الشبكة لخمس ثوان. افصل أصابعك، وجهد الورق النشاف وأزاله بسرعة من سطح الشبكة. في وقت واحد، اضغط على دواسة القدم للافراج عن الذراع الغطس اليدوي، يغرق الملاقط عقد الشبكة في الإيثان السائل.
الحفاظ على الشبكة المجمدة حديثا في الإيثان السائل، وفصل بعناية ملاقط من الذراع يغرق دليل. بعناية الامم المتحدة المشبك ملاقط بحيث تكون الشبكة قابلة للإزالة. نقل الشبكة إلى خزان النيتروجين السائل تحت وعاء الإيثان النحاسي مع حركة واحدة سريعة من الإيثان إلى النيتروجين السائل.
ضع الشبكة في مربع الشبكة. النتائج التمثيلية. من هذا الفيديو ، يجب أن يكون الباحثون قادرين على إعداد شبكات CryoEM ، مثل هذا ، مع العديد من المربعات التي تحتوي على أفلام رقيقة من الجليد الزجاجي للتصوير عالي الدقة.
يمكن ضبط تركيز العينة ووقت النشاف لتحسين كثافة الجسيمات. هنا، سوف نظهر سير العمل الكامل لتجميد عينات CryoEM باستخدام أسلوب لطخة والغطس. استخدام ملاقط لقط نظيفة لالتقاط شبكة جديدة وتأمين الشبكة في مكان.
تطبيق ثلاثة ميكرولترات من العينة إلى الجانب المائي من الشبكة وتأمين ملاقط إلى الذراع الغطس اليدوي عن طريق التفاف الشريط حول مقبض ملاقط. ضع الورق النشاف بالتوازي مع سطح الشبكة وثني الورق النشاف برفق نحو الشبكة لبدء النشاف. بعد الوقت المطلوب، قم بتحريك ورقة النشاف في حركة عض بعيدا عن سطح الشبكة بينما قم بتكئيب دواسة القدم لإطلاق الذراع المنغمسة، مما أغرق الشبكة في الإيثان السائل.
فك بعناية الشريط من جميع أنحاء ملاقط والذراع اليدوي يغرق. مع حركة واحدة سريعة، نقل الشبكة بسرعة من وعاء الإيثان إلى خزان النيتروجين السائل. ضع الشبكة في مربع تخزين الشبكة ولف الملاقط في مسح كيم لتجف؛ كرر.
