تسمح التقنية التي نقدمها اليوم بتحليل نشاط الخلايا العصبية في الحبل الشوكي نتيجة للعامل العصبي الداخلي وتأثير الخلايا النجمية المحيطة. تولد هذه التقنية بشكل موثوق كلا من الخلايا العصبية البشرية والخلايا النجمية البشرية الخاصة بالحبل الشوكي وتستخدم مقياس إخراج وظيفي يمكن قياسه من أجل التكاثر. تسمح التقنية التي نقدمها بالتحقيق في أمراض معينة من خلايا الحبل الشوكي مثل التصلب الجانبي الضموري ، باستخدام الخلايا العصبية من المرضى الذين يعانون من مرض متقطع أو وراثي.
بادئ ذي بدء ، افحص لوحات iPSC البشرية بحثا عن مستعمرات كثيفة بدرجة كافية بحيث يعرض مركز المستعمرات مناطق بيضاء متناثرة. ثم لبدء تعبئة الخلايا ، ارسم خطوط شبكية على السطح الخارجي السفلي للألواح بعلامة لتسهيل التغطية الدقيقة للوحة بأكملها. استخدم مجهر تباين الطور بتكبير 10x في ثقافة لفصل المستعمرات المتمايزة عن طريق الكشط يدويا بطرف ماصة 200 ميكرولتر.
بعد ذلك ، شطف لوحات مرتين مع PBS. ثم أضف خمسة ملليلتر من بروتياز تفكك الأنسجة قبل تسخينه عند 37 درجة مئوية. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أربع إلى سبع دقائق حتى تبدأ حواف المستعمرات في التقريب ، قبل رفع المستعمرات من اللوحة.
استنشاق بعناية البروتياز التفكك وشطف بلطف لوحة مرتين مع PBS دون إزاحة المستعمرات. أضف خمسة ملليلتر من وسيط iPSC البشري الذي تم تسخينه مسبقا إلى لوحة الثقافة. ثم خدش اللوحة بأكملها بطرف ماصة سعة خمسة ملليلتر باستخدام حركة ذهابا وإيابا من أعلى إلى أسفل وارفع المستعمرات أثناء تقسيمها إلى مجاميع خلايا أصغر.
لتمايز iPSC البشري إلى خلايا سلفية عصبية. بمجرد أن يشكل iPSC البشري طبقة أحادية ويصبح 90٪ متقاربا ، ابدأ التمايز كما هو موضح في المخطوطة. في اليوم 12 ، بعد العلاج بالتربسين ، إذا لم تكن الخلايا معلقة ، يتم فصل الخلايا ميكانيكيا عن طريق إخراج وسط الحث العصبي من طرف ماصة 1000 ميكرولتر على الخلايا بحركة دائرية لتغطية السطح بالكامل.
إذا تم تجميد مزارع الخلايا السلفية العصبية ، قم بإذابتها. بعد التبادل المتوسط وشطف PBS كما هو موضح في المخطوطة ، قم بتغيير الوسط باستخدام وسط تمايز الخلايا العصبية الحركية الذي يحتوي على 0.02 ميكرومولار سيتوزين أرابينوسيد ثم احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون عندما تظهر السلف الدبقية الملتزمة كخلايا مسطحة مفردة تتكاثر تحت أسلاف الخلايا العصبية الحركية بعد الانقسام ، مجمعة في مجموعات خلوية. في وقت لاحق ، أجرى تبادلا متوسطا كما هو موضح في المخطوطة.
في يوم الطلاء أو قبل ذلك ، ابدأ في طلاء 24 لوحة MEA للبئر عن طريق تخفيف PLO أولا في الماء أو PBS. ثم أضف 15 إلى 20 ميكرولتر من PLO إلى كل بئر لتشكيل قطرة في وسط البئر ، تغطي منطقة القطب لضمان عدم إتلاف الأقطاب الكهربائية بطرف الماصة. أضف الماء إلى المقصورات المحيطة بالآبار ، مما يضمن رطوبة كافية.
واحتضان PLO عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين. ثم باستخدام طرف ماصة بلاستيكية صغيرة ، استنشاق أكبر قدر ممكن من PLO دون لمس الأقطاب الكهربائية. بعد ذلك ، اغسل البئر ب 250 ميكرولتر من الماء ثلاث مرات.
باستخدام طرف ماصة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الماء واترك السطح يجف مع إزالة الغطاء. بعد ذلك ، أضف 15 إلى 20 ميكرولتر من اللامينين المخفف لتغطية كل مجموعة أقطاب كهربائية. بعد إضافة الماء إلى حجرات الرطوبة واستبدال الغطاء ، احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن ساعتين حتى ليلة وضحاها.
في يوم الطلاء ، بعد شطف الخلايا العصبية الحركية ومزارع الخلايا النجمية مرة واحدة باستخدام PBS ، أضف 0.05٪ تربسين واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لرفع الخلايا. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر يحتوي على مثبطات التربسين. وغسل الأطباق ذات الوسط أو القاعدة لضمان جمع جميع الخلايا.
بيليه أسفل الخلايا عن طريق التمركز. ثم باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ، أعد تعليق الخلايا العصبية الحركية والخلايا النجمية باستخدام وسط استزراع مشترك يحتوي على 20 ميكرومولار من مثبط ROCK لتوليد ملليلتر واحد من معلق خلية واحدة. باستخدام مقياس الدم ، عد الخلايا العصبية الحركية والخلايا النجمية.
وأثناء العد ، احتفظ بمعلقات الخلية وضعها في رف الستايروفوم عند أربع درجات مئوية. جهاز طرد مركزي ملليلتر واحد من كلا معلقات الخلية عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق. احسب الحجم المطلوب وأعد تعليق الكريات.
اجمع بين الحجم المطلوب من معلقات الخلايا العصبية والخلايا النجمية بنسب متساوية ، واخلطها برفق عن طريق السحب مرتين لتتحد جيدا. ثم قم بإزالة laminin من كل بئر من اللوحة ونقل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية المدمج النهائي إلى كل بئر ، لتشكيل قطرة صغيرة تغطي مجموعة القطب. احتضن الألواح بقطرة خلية غير مضطربة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة لتشكيل مرفقات أولية على الألواح.
ثم ماصة 250 ميكرولتر من وسائط الاستزراع المشترك الدافئة التي تحتوي على مثبط الصخور لأسفل على جدار كل بئر وماصة بنفس الحجم على الجدار المقابل لكل بئر واحتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 إلى 36 ساعة. في اليوم التالي ، افحص الألواح بحثا عن الحطام أو الخلايا الميتة. وإذا لزم الأمر ، استبدل الوسيط بوسط استزراع مشترك جديد يحتوي على مثبط ROCK.
بخلاف ذلك ، قم بإجراء تبادلات نصف متوسطة مرتين في الأسبوع باستخدام وسيط استزراع مشترك بدون مثبط ROCK بدءا من اليوم الثاني للاستزراع المشترك. لإجراء التسجيل ، ابدأ في أقرب وقت ممكن بعد اليوم الأول من الزراعة المشتركة عن طريق ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون عند 5٪ ثم انقل الألواح إلى آلة التسجيل وازنها لمدة خمس دقائق على الأقل قبل التسجيل. سجل نشاط خط الأساس كل يومين أو أسبوعيا على مدار دقيقة إلى 15 دقيقة حسب التصميم التجريبي.
للتحقيق في التأثيرات الفيزيولوجية الكهربية العابرة للمركبات التي تستهدف الخلايا العصبية أو الخلايا النجمية ، قم بإزالة غطاء اللوحة ولكن احتفظ بغطاء الجهاز مغلقا وسجل نشاط خط الأساس لمدة دقيقة واحدة على الأقل. افتح غطاء الماكينة يدويا دون إيقاف التسجيل الكهربي واستبدل 25 ميكرولترا من الوسط مع مركبة الدواء المناسبة. ثم أغلق الغطاء يدويا وسجل لدقائق إضافية إذا لزم الأمر.
وبالمثل ، اختبر الدواء محل الاهتمام. في هذا البروتوكول ، تم الحفاظ على hiPSCs وتمريرها كمستعمرات غير متقاربة. بدأ تكوين الخلايا العصبية من خلال تثبيط SMAD المزدوج عن طريق تعطيل مسارات BMP و TGF-beta.
انقسمت الخلايا الجذعية الظهارية العصبية الناتجة وولدت ظهارة متعددة الطبقات. أدى التعرض المبكر لعوامل نمو الخلايا العصبية وعامل التغذية العصبية الهدبية الدبقية إلى تكوين مجموعة مختلطة من الخلايا السلفية. ظهرت الخلايا العصبية تلقائيا من هذه المجموعة المختلطة.
تسبب التبديل الدبقي في تمايز الخلايا النجمية من خلال تنشيط مسار JAK-STAT. تم دعم هوية الحبل الشوكي لمثبطات الشق المعالجة والخلايا العصبية الحركية المتمايزة بمستويات عالية من تعبير أسيتيل ترانسفيراز الكولين. في اليوم 90 بعد الزراعة في المختبر ، أظهرت الخلايا النجمية البشرية iPSC النمط الظاهري الناضج كما هو موضح في تعبير S100 beta و GFAP بينما تم دعم هويتها الإقليمية للحبل الشوكي من خلال التعبير عن الصقور من قبل.
أعيد ترتيب الخلايا المستزرعة بشكل تلقائي مع الخلايا النجمية التي تخلق طبقة تغذية في الأسفل والخلايا العصبية التي تربط الشبكات في الأعلى. الخلايا العصبية المجمعة في مجموعات خلايا كبيرة عند زراعتها بمفردها ، في حين أن الثقافة المشتركة للخلايا العصبية الحركية البشرية iPSC مع الخلايا النجمية البشرية iPSC أدت إلى طبقات أحادية موزعة بالتساوي. عززت الخلايا النجمية البشرية iPSC النضج الكهربي للخلايا العصبية الحركية البشرية iPSC كما يتضح من درجات أعلى من النشاط المرتفع والانفجار في الثقافات المشتركة.
في تجربتنا ، تعد زراعة الخلايا الجذعية والتمايز المبكر ل NPC هي الأكثر صعوبة وحساسية للخطأ الفني. في هذه المرحلة ، يجب عدم تنفيذ التقنيات باتساق ودقة مع هامش ضئيل لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. يمكن استخدام تقنيات الاستزراع المشترك الموصوفة هنا في نماذج أخرى خاصة بنوع الخلية أيضا.
