هذا هو البروتوكول الأول الذي يوضح العدوى المشتركة الناجحة للجهاز القشري الشوكي في الفئران الوليدية. يوفر مخططا دقيقا للتحقيق في كيفية مساهمة المجموعات الفرعية الفردية للخلايا في الثدييات الشابة في التعافي من إصابة الحبل الشوكي. مثل تقنيات النواقل الفيروسية المزدوجة الأخرى ، تسمح هذه الطريقة للمستخدم بتحويل مجموعات فرعية محددة من الخلايا العصبية بدقة ، مما يسمح للباحثين بتحديد فعالية التقنيات الكيميائية الوراثية المختلفة في تعزيز التعافي.
نتوقع من الباحثين الذين ليسوا على دراية بهذه التقنية أن يكافحوا من أجل تحديد موقع تشريح العمود الفقري المناسب. ولذا فإننا نشجعك على عد الأجزاء الفقرية باستمرار في كثير من الأحيان والرجوع دائما إلى معالمك. بعد التأكد من عمق التخدير في جرو Sprague Dawley الوليدي ، حدد المنطقة التي سيتم إجراء الشق فيها عن طريق الضغط على الملقط في خط الوسط أعلى فروة الرأس ، والشعور بالخيط السهمي.
إمساك الجلد مشدودا لضمان شق نظيف ومستقيم ودقيق ، قم بعمل شق بطول سنتيمتر واحد على طول مستوى الخياطة السهمي بدءا من الخط الأول مباشرة. بعد ذلك ، حدد bregma عن طريق فحص الملقط بلطف على طول سطح الجمجمة ، مع إيلاء اهتمام وثيق لخطوط الخياطة والمسافة البادئة التي يسببها الملقط الذي يمتد على طول العظام الجدارية والجبهية. الحفاظ على الفتحة عن طريق تطبيق السنانير المرجحة على جانب الاهتمام.
قم بإزالة التهاب الأعصاب باستخدام مزيج من الأطراف القطنية والمقص الدقيق لزيادة التعرض للبريجما لزيادة الدقة. تأكد من أن الدرز الإكليلي في رؤية واضحة بما يكفي لتوفير قالب تقريبي للحقن اللاحقة. باستخدام المقص الصغير ، قم بقطع جزء من ثلاثة في اثنين ملليمتر تقريبا من عظم الجمجمة الجبهي الأيسر المجاور مباشرة للبريغما.
قم بإزالة أي حطام أو سائل دماغي ودم بأطراف قطنية. لحقن الفيروس ، ضع الإبرة في مكانها وقم ببرمجة الحاقن لحقن ميكرولتر واحد بمعدل 250 نانولتر في الدقيقة. عند الانتهاء من الحقن ، اترك الإبرة تستقر في القشرة لمدة ثلاث دقائق.
كرر الحقن في الإحداثيات الأخرى لما مجموعه ثلاث حقن على طول القشرة فيما يتعلق بالبريغما ، وكلها على عمق 0.6 ملم. بعد الانتهاء من الحقن ، خياطة فروة الرأس ونقل الحيوان إلى طاولة العمليات الأخرى لاستئصال الصفيحة الفقرية عنق الرحم. جس قاعدة الجمجمة باستخدام الأصابع لتحديد موقع الشق.
امسك الجلد مشدودا عن طريق وضع التوتر بالإبهام والسبابة. باستخدام شفرة رقم 11 ، ابدأ الشق عند خط الوسط من واحد إلى ملليمترين خلف قاعدة الجمجمة وقم بتمديد الشق الخلفي بمقدار سنتيمتر واحد لكشف العضلة السطحية. باستخدام النقطة الحادة للشفرة ، قم بإجراء سلسلة من الجروح برفق على طول خط الوسط للعضلة السطحية لكشف تجويف العمود الفقري وعضلات العمود الفقري العميقة.
ثم استخدم زوجا من الملقط لنشر العضلات المفتوحة وتصور النافذة الجراحية. بمجرد انكشاف عضلات العمود الفقري العميقة ، أدخل المبعدات في النافذة الجراحية واسحب النافذة الجراحية إلى سبعة إلى ثمانية ملليمترات في العرض ، مما يسمح برؤية العمود الفقري دون عائق. حدد الفقرة العنقية الثانية من خلال عمليتها الشائكة البارزة التي تبرز ظهريا وتغلف عضلة كبيرة على شكل قبة.
باستخدام الحافة المسطحة لمكشطة العظام ، اكشط برفق عضلة العمود الفقري العميقة على الجانبين لتعريض الفقرات C3 إلى C7. ابدأ الإنسي وكشط أفقيا على طول الاتجاه الموازي للصفائح الفقرية لضمان التعرض المناسب ، مما يسمح بتمييز واضح للصفائح الفقرية. السيطرة على أي نزيف مع أطراف القطن.
باستخدام C2 كدليل عند حساب مستويات العمود الفقري ، قم بقص الحواف الجانبية للصفائح الغضروفية بعناية عند C6 و C7 باستخدام مقص صغير. باستخدام زوج من الملقط الناعم ، قم بإزالة الجزء المقطوع بعناية من الصفيحة لكشف الحبل الشوكي ، وتأكد من أن نافذة العمود الفقري كبيرة بما يكفي لاستيعاب موقع الحقن المطلوب. ضع الحيوان في حامل الجمجمة المجسم وضع قطعة من الشاش ملفوفة تحت جذع الحيوان لرفع أرباعه الخلفية.
قبل البدء في الحقن ، قم بتنظيف نافذة العمود الفقري من أي دم أو سائل دماغي نخاعي عن طريق وضع أطراف قطنية ومثلثات سوجي برفق على المنطقة ، مع الحرص على عدم إهانة الحبل الشوكي. علاوة على ذلك ، قم بإنشاء حاجز حول محيط النافذة عن طريق وضع قطعة صغيرة من القطن القابل للامتصاص في الأجزاء الجانبية من نافذة العمود الفقري لمنع انسداد موقع الحقن عن طريق النزيف المستمر أو تسرب السائل الدماغي النخاعي. للحقن المباشر في الحبل الشوكي، استخدم طرف إبرة حقن الزجاج لتقريب خط الوسط للحبل الشوكي عن طريق تحديد الشريان الشوكي.
بعد ذلك ، ضع الإبرة خلف الصفيحة C5 مباشرة عند خط الوسط التقريبي واستخدمها كنقطة مرجعية. ثم ، باستخدام المناور الدقيق ، حرك الإبرة أفقيا إلى اليمين بمقدار 0.3 ملم وخفض الإبرة حتى تلامس سطح الحبل الشوكي. من هذا العمق ، يغرق الإبرة.
0.6 ملليمتر في الحبل الشوكي. حقن ميكرولتر واحد من الفيروس المرتبط بالغدي الرجعي الذي يحمل جين Cre recombinase بمعدل 250 نانولتر في الدقيقة. ثم انتظر لمدة دقيقتين حتى ينتشر الفيروس في الحبل الشوكي قبل سحب الإبرة ببطء.
يظهر هنا وضع العلامات على الخلايا العصبية القشرية الشوكية من الطبقة الخامسة في القشرة الحركية لقسم إكليلي في الدماغ يعبر عن DREADDs المعتمدة على Cre mCherry المحقونة بالاشتراك مع حقن العمود الفقري المقابل ل Cre الرجعي. ستساعد القدرة على استهداف مجموعات عصبية معينة على تحديد الفروق الدقيقة التي تقود الانتعاش وتوفير المزيد من الدقة لعلاج إصابة الحبل الشوكي الأساسية في الجهاز العصبي النامي. مهدت هذه الطريقة الطريق لنا للتحقيق في جدوى استخدام DREADDs المثيرة كوسيلة لعلاج إصابة الحبل الشوكي في الفئران اليافعة.
