ويساعد هذا البروتوكول في عزل الاندوسومات المعاد تدويرها التي تحتوي على جزء من خلايا الثدييات المتحولة جنسيا لتسهيل التحقيق في الاتجار بالبروتين عن طريق الاتجار بالغدد الصماء. هذه التقنية سهلة للتعامل معها وقابلة للتطبيق على كل من عينات الأنسجة والخلايا. إثبات الإجراء سيكون الآنسة تشاي يو تشي، طالبة دكتوراه من مختبر الدكتور لاو.
للبدء، لوحة 2 مرات 10 إلى 6 خلايا في طبق ثقافة 100 ملليمتر. في اليوم التالي، تحويل الخلايا مع ليبولاكتامين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لحصاد الخلايا، تجاهل متوسط الثقافة 48 ساعة بعد العدوى وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
ثم إضافة ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS تكملها 0.5X كوكتيل مثبط البروتيز في 0.5X كوكتيل مثبط فوسفاتاز إلى كل طبق. بعد ذلك، باستخدام مكشطة الخلية، وجمع الخلايا ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر. الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام دوار دلو سوينغ.
تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية بلطف في خمسة ملليلتر من العازلة التجانس. جمع الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي وإعادة إنفاق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من العازلة التجانس. تجانس الخلايا مع التجانس Dounce باستخدام 15 إلى 20 السكتات الدماغية.
ثم نقل المتجانس إلى أنبوب الطرد المركزي ملليلتر اثنين. إضافة 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت التجانس إلى المتجانسة. ثم تدور المتجانس المخفف وجمع 1.5 ملليلتر من supernatant.
تدور supernatant التي تم جمعها مرة أخرى ، ثم جمع 1.4 ملليلتر من supernatant وتسميتها بأنها ما بعد النووية العملاقة. لإعداد عمود تدرج الكثافة، قم بنقل 1.2 ملليلتر من الناسخ الفائق بعد النووية إلى أنبوب طرد مركزي فائق. ثم أضف ملليلتر واحد من محلول السكروز بنسبة 62٪ إلى العينة واخلط جيدا عن طريق الأنابيب اللطيفة.
بعد ذلك ، أضف بعناية 3.3 ملليلتر من محلول السكروز بنسبة 35٪ فوق العينة ، يليه 2.2 ملليلتر من محلول السكروز بنسبة 25٪ بالإضافة إلى محلول السكروز بنسبة 35٪. وأخيرا، ملء أنبوب الطرد المركزي للغاية إلى الأعلى مع العازلة التجانس. طرد مركزي عمود الانحدار الكثافة وجمع بعناية 12 كسر من 1 ملليلتر لكل منهما، بدءا من أعلى التدرج.
بعد ذلك، تمييع جميع الكسور مع ملليلتر واحد من العازلة تخفيف والطرد المركزي العينات المخففة. بعد الطرد المركزي، يستنشق supernatant وإضافة 50 ميكرولتر من العازلة عينة 1X لحصاد الكسور. تم الكشف عن علامة إعادة التدوير الإندوسوم Rab11 في الكسر السابع.
كما تم بحث علامات أخرى دون الخلوية، بما في ذلك بيتا COP، COX IV، GAPDH، EEA1، راب 7، و Lamp1. كما تم الكشف عن إشارة إيجابية EEA1 في الكسر السابع. تظهر هنا كثافة النطاق المقاسة ل GAPDH و Cox IV و Rab11 في كل من الكسر السابع والناطقة الفائقة بعد النووية.
بعد تحويل خلايا HEC293 إما مع ELMO1 أو ELMO1 ARF6Q67L أو ELMO1 ARF6Q67L FE65، لم يتم العثور على أي تغييرات في توزيع ELMO1 مع التعبير الزائد ARF6Q67L و FE65. تمت مقارنة مستوى ELMO1 في الكسر السابع بين المقاطعات المختلفة ووجد أنه مرتفع بعد إصابة ARF6Q67L. ولوحظت زيادة أخرى عندما شارك في التعبير عن كل من ARF6Q67L و FE65.
وعلى العكس من ذلك، فإن ضرب FE65 قلل من تخصيب ال ARF6 بوساطة إلمو1 في الجزء السابع. ويمكن استخدام الكسر الذي تم الحصول عليه للتحليل اللاحق. على سبيل المثال، النشاف الغربي لتصور التغيرات مستوى البروتين في الكسر.
