بسيطة في المنزل فائقة الأداء تصنيع العمود الشعرية مع نهج FlashPack. الهدف من هذا الإجراء هو إدخال بروتوكول الأمثل لسرعة وسهولة فائقة عالية الأداء التعبئة عمود الشعرية لتحليل بروتيوميات LC-MS. ويستند البروتيوميات الحديثة على قياس الطيف الكتلي إلى جانب الكروماتوغرافيا السائلة الشعرية فائقة الأداء.
يتم فصل الببتيد في الغالب في أعمدة شعرية يبلغ قطرها الداخلي 75 ميكرومتر. على قدم المساواة مع المنتجات التجارية، فمن الممكن لإعداد أعمدة الشعرية في المنزل. توضح الأعمدة المعدة خصيصا صفات الفصل المشابهة للتشبيهات التجارية ، مع توفير الكثير من المال والسماح بتخصيص حجم الأعمدة والممتزات.
هنا نحن نثبت إجراء التعبئة الأمثل لتصنيع العمود الشعري في المنزل ، والذي نسميه FlashPack. الفكرة وراء التحسين هو حزمة من تركيز الطين ماصة عالية جدا، في حين لا تزال تستخدم نفس الشائعة 100 شريط ضغط قنبلة التعبئة الإعداد. وهذا يتطلب تفكيك مستمر لمجموعات المواد الماصة، والتي تتشكل حول مدخل العمود بتركيز ماصة عالية ومنع المواد الماصة الجديدة من دخول الشعرية.
من الناحية الفنية، ونحن نحقق ذلك باستخدام شريط المغناطيس كمطرقة، والتدفئة باستمرار والتحرك حول الشعرية داخل السلك ماصة. تطبيقها بشكل صحيح FlashPack يزيد معدل التعبئة تصل إلى 10 مرات. وهذا يجعلها مناسبة لتعبئة المواد الماصة عالية الأداء فائقة من ليونة حجم metricbeat الصغرى وتصنيع أعمدة طويلة جدا تصل إلى طول متر في أوقات معقولة.
يتكون إجراء إعداد العمود من خمس خطوات. ثلاث خطوات تحضيرية، والتي تشمل تجميع محطة التعبئة وإعداد الملاط الشعري والممتز. ثم يتم تعبئة الشعرية أولا في قنبلة الضغط في ضغط 60 إلى 100 شريط.
ويتبع ذلك اتصال من الشعيرات الدموية معبأة لنظام HPLC، والتعبئة حتى ماصة في الضغط العالي وقطع العمود إلى الحجم. يتطلب إجراء FlashPack إجراء تغييرات في الخطوتين الثالثة والرابعة من البروتوكول المشترك. أولا، نحن نعد محطة تعبئة.
وهو يتألف من خزان غاز النيتروجين مع ما لا يقل عن 50 القضبان منفذ الضغط. يتم توصيل الخزان إلى صمام تنفيس قنبلة الضغط، والتي يتم وضعها في stirrer المغناطيسي. يتم إدخال منفذ صمام تنفيس في زجاجة مياه من خلال ضيق ID PEEK الشعيرات الدموية، والذي يسمح السيطرة الدقيقة على الاكتئاب.
بعد ذلك، ونحن إعداد الشعرية. ويمكن القيام به التعبئة إما في الشعرية fritted مع فريت الزجاج المتكاملة التي شكلت من كاسيل وفورماميد. خيار آخر هو حزمة في الشعرية سحبت أعدتها سحب الليزر سوتر.
يجب جعل الشعرية أطول من طول العمود المقصود ب 10 إلى 15 سنتيمترا. يتم إعداد الفيديو التالي على سبيل المثال من التعبئة الشعرية باعث سحبها. حماية نهاية باعث سحبت مع قطع هلام تحميل ماصة تلميح.
للاطلاع على التفاصيل، راجع النسخة النصية للمخطوطة. المرحلة التالية هي إعداد الطين الماصة. أولا، وضع حوالي 50 ملليغرام من المواد الماصة الجافة في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر.
ستكون قارورة ماصة للمخزون تم إعداد هذا الفيديو باستخدام Reprosil Pur C18 AQ 1.9 ميكرو متري ماصة من Dr.Maisch. إضافة ملليلتر واحد من الميثانول في قارورة المواد الماصة المخزون.
دوامة لمدة 10 ثوان. و sonicate في حمام سونيكيشن لمدة 10 ثانية أخرى. دع الممتز ينقع جيدا لمدة 20 إلى 30 دقيقة، ثم دوامة و sonicate مرة أخرى.
إعداد قارورة ماصة العمل. يجب أن تكون قارورة قاع مخروطية تناسب القنبلة. يمكن أن يكون إما أنبوب طرد مركزي آخر 1.5 ملليلتر أو أي قارورة أخرى اعتمادا على تصميم قنبلة ضغط معينة.
نحن نستخدم أنبوب غطاء المسمار السفلي المخروطي الملتف إلى ذروة قنبلة الضغط. إعادة تعليق المواد الماصة في قارورة المواد الماصة الأسهم ونقل 500 ميكرولتر في قارورة ماصة العمل جنبا إلى جنب مع شريط المغناطيس اثنين في حجم ثلاثة ملليمترات. أعلى إلى قارورة العمل إلى ملليلتر واحد مع الميثانول.
دع قارورة العمل تقف على الطاولة لمدة 10 دقائق حتى يستقر الممتز بالجاذبية. يجب أن تكون نتيجة هذه الخطوة قارورة قاع مخروطية مع الطبقة السفلية من المواد الماصة فضفاضة حوالي أربعة ملليمترات عالية. إذا كانت الطبقة منخفضة جدا، وبعض أكثر ماصة من قارورة الأسهم.
وبالتالي أعدت قارورة العمل مخصصة لعدة أعمدة'إعداد على مدى أشهر من الزمن. إذا بقيت القارورة الماصة العاملة دون تحريك لأكثر من ساعتين ، فيجب أن تكون دوامة ، سونيكاتيد ومستقرة بالجاذبية مرة أخرى قبل التعبئة. عندما يتم إعداد كل شيء، انتقل إلى المرحلة الرابعة، والتعبئة في قنبلة الضغط.
ارتداء النظارات الواقية دائما عند العمل مع الشعيرات الدموية السيليكا تنصهر وقنبلة الضغط. في الوقت نفسه، لا ينصح قفازات واقية. أنها تقلل بشدة من الشعور باللمس المطلوبة للتعامل السليم مع الشعيرات الدموية قطرها صغيرة وتؤدي إلى أخطاء.
ضع القارورة الماصة في قنبلة الضغط وأصلح جميع العقد بإحكام. بدء التناوب في 60 إلى 100 طلقة في الدقيقة الواحدة، إدراج الشعرية fritted أو سحبها في القنبلة. ادفعها إلى أسفل القارورة، ثم ارفعها من 2 إلى 3 ملليمترات وأصلح العقدة.
تطبيق الحد الأدنى من القوة المطلوبة لإصلاح الشعرية. تأكد من أن الشعرية ثابتة بشكل صحيح. يجب أن يكون من المستحيل تحريك الشعرية عن طريق سحبها باليد.
ببطء شديد، افتح صمام قنبلة الضغط مع الحفاظ على الطرف المفتوح من الشعرية مدببة بعيدا عن وجهك. شاهد الخطوات الأولية لعملية التعبئة. فور الضغط ، يملأ الممتز الشعرية ويصبح غير شفاف طوال المدة.
بمجرد أن يبدأ الممتز في حزمة داخل نهاية البعيدة، ويزيد الضغط الخلفي، ويتباطأ تدفق والطين حتى ماصة داخل الإصلاحات الشعرية في العديد من الحزم ماصة، مفصولة الفجوات الحرة ماصة. المواد الماصة معبأة بالفعل مرئية كمنطقة ذات ألوان كثيفة تنمو باستمرار. الحفاظ على المناطق الماصة مملوءة لتكون على الأقل 70٪ من طول الشعرية مع فجوات حرة صغيرة ماصة طوال مدة عملية التعبئة.
هناك العديد من القضايا الشائعة لمشاهدة أثناء عملية التعبئة. أنها تتطلب على متن الطائرة الإعداد التكيف للحفاظ على كفاءة تسليم المواد الماصة في الشعرية. القضية الأكثر شيوعا هو عندما يتوقف المواد الماصة الجديدة دخول الشعرية في حين أن المواد الماصة بالفعل داخل يحتفظ تتحرك.
في معظم الحالات، يتم حظر المدخل الشعري بواسطة مجموعات ماصة ذاتية التجميع. تطبيق هذه الخطوات واحدا تلو الآخر حتى يتم استعادة تدفق المواد الماصة، ثم تخطي بقية الخطوات المتعلقة المشكلة. زيادة سرعة الدوران إلى 500 جولة في الدقيقة، والحد منها فورا مرة أخرى إلى 60 دورة في الدقيقة.
معظم الوقت يستعيد تدفق المواد الماصة. تحقق من سرعة الدوران لتكون على الأقل 60 دورة في الدقيقة لبقية عملية التعبئة. إذا لم يساعد، تنفيس لفترة وجيزة قنبلة التعبئة والضغط على الفور مرة أخرى.
إذا لم يساعد، أو منع يحدث مرة أخرى، وإعادة وضع الشعرية داخل طبقة ماصة. يمكن أن يكون غياب المواد الماصة بسبب أن الشعيرات الدموية المفتوحة إما عالية جدا فوق شريط المغناطيس ، لذلك لا تلمسها نهاية العمود. أو يتم وضع الشعرية منخفضة جدا والعصي في أسفل القارورة.
أولا، تنفيس القنبلة تماما، ثم تخفيف الجوز، ودفع الشعرية إلى أسفل، ومن ثم سحبها ملليمترين إلى الوراء. إصلاح الجوز. افتح الصمام للضغط على القنبلة ومواصلة التعبئة.
يتم وصف مزيد من التفاصيل حول مشاكل التعبئة في الإصدار النصي من الأسلوب. استمر في تعبئة العمود حتى يتم تحقيق طول العمود المستهدف بالإضافة إلى خمسة إلى سبعة سنتيمترات. وقف التناوب والاكتئاب ببطء شديد القنبلة.
فتح صمام القنبلة قليلا وانتظر انفجار فقاعة داخل زجاجة المياه لتهدأ. ثم فتح صمام أوسع قليلا ومرة أخرى الانتظار لانفجار فقاعة لإبطاء. وهكذا في خطوات تدريجية، والإفراج عن الضغط حتى لا يخرج الغاز من صمام.
لا تفتح الصمام على طول الطريق في وقت واحد. وسوف يؤدي إلى محتدما داخل الشعرية والممتزة العودة إلى القارورة. إذا حدث ذلك، اضغط على القنبلة مرة أخرى وانتظر العمود للحصول على معبأة مرة أخرى.
عندما يتوقف الغاز عن الخروج من صمام التهوية، أخرج الشعرية المعبأة من قنبلة الضغط. لا تدع العمود يجف. إذا لم يتم توصيله بنظام HPLC على الفور لمزيد من التعبئة ، ضع الشعيرات الدموية المعبأة في التخزين عن طريق غمرها بالكامل في محلول الإيثانول بنسبة 10٪.
يتم تخزين أعمدة HPLC غير المتصلة بنفس الطريقة. إذا لم يكن من المقرر التعبئة أكثر لهذا اليوم، والخروج قارورة ماصة من القنبلة وإغلاقه بإحكام. يبقيه لمزيد من التعبئة العمود.
المرحلة الخامسة، (إتش بي إل سي) تحزم أمتعتها. قم بتوصيل الشعيرات الدموية المعبأة بنظام HPLC عبر اتصال HPLC. بدء تدفق المذيبات العضوية العالية.
ضبط تدفق وفقا لطول معبأة تستهدف حوالي 300 القضبان. ل40 سم معبأة الشعرية استخدام معدل تدفق 200-300 لتر العادي في الدقيقة الواحدة. مشاهدة لمتمتة فضفاضة داخل الشعرية التي معبأة، إضافة إلى طول معبأة مجموع.
دون وقف تدفق، تراجع الجسم العمود مرتين في حمام سونيكيشن. من المهم أن تزج جزء فقط من الجسم العمود. لا تزج نهايات العمود والاتصالات الشعرية.
عندما يتوقف السرير الماصة تقلص، تراجع الجسم العمود في حمام سونيكيشن مرتين أكثر دون وقف تدفق. تشغيل العمود لمدة 10 دقائق إضافية في 300 أشرطة. أوقف التدفق وانتظر حتى ينخفض الضغط إلى أقل من ثلاثة أشرطة وافصل العمود.
فحص العمود بصريا لعدم وجود ثغرات وتلونات. إذا تم العثور على أي، سونيكيشن تحت تدفق يمكن تكرارها. بالنسبة للتجارب الهامة، فكر في إنشاء عمود جديد.
قص العمود إلى الطول المطلوب. قطع القيام به بشكل صحيح هو شرط أساسي لكفاءة العمود. جعل درجة في طلاء البولي أميد مع الكاتب.
كسر جزئيا الشعرية، وسحب قطعتين بعيدا. البولندية العمود الأمامي على رقاقة السيراميك أو مع فيلم اللف. أعد توصيل العمود بنظام LC باستخدام اتصال الضغط العالي جدا.
بدء معدل تدفق العمل عند 2٪B. يتم ضبط معدل تدفق العمل وفقا لمعلمات العمود. على سبيل المثال، يتم تشغيل 100 عمود معرف ميكرومتر بمعدل 500 نانولتر في الدقيقة.
انتظر الضغط لتوازن وتحقق من العمود الضغط الخلفي. يعطي العمود المعد بشكل صحيح ضغطا خلفيا يتناسب مع طوله وخصائصه الماصة. على سبيل المثال، عمود شعري طوله 30 سنتيمترا معبأ بممتزين ميكرومترين يحتوي على ضغط خلفي يتراوح بين 450 و500 شريط عند 2٪ مذيب B.If يعطي العمود المنتج ضغطا خلفيا ضمن النطاق المتوقع، فهو جاهز للاستخدام.
إذا كان الضغط الخلفي خارج النطاق المتوقع ، فهناك خطأ ما إما في العمود أو في نظام LC. التعبئة مع FlashPack تنتج الشعرية معبأة لمدة 50 سنتيمترا مع 1.9 ميكرومتر ماصة في أقل من ساعة واحدة في 100 شريط ضغط التعبئة. على سبيل المثال، نحن ننتج 30 سنتيمترا 100 ميكرومتر معرف الترا عمود الضغط العالي معبأة في الشعرية باعث سحبت مع 1.9 ميكرومتر ReprosilPur C18 AQ ماصة.
تم التعبئة في 60 القضبان إلى 50 سنتيمترا طويلة سحب الشعيرات الدموية الباعثة. كانت معبأة الشعرية إلى 40 سنتيمترا في 40 دقيقة مع بعض أكثر ماصة داخل الشعرية ليست معبأة. تم توصيل الشعيرات الدموية المعبأة بنظام HPLC وتشغيلها بمعدل 300 نانولتر في الدقيقة مع المذيب B ، والتي كانت في حالتنا 80٪ أسيتونيتريل ، 0.1٪ حمض الفورميك.
وكان الطول النهائي معبأة 43 سنتيمترا. تم قطع العمود 30 سنتيمترا. في 500 نانولتر في الدقيقة تدفق العمل مع 99٪ المذيبات B أعطى العمود الضغط الخلفي من 275 القضبان، والتي هي قريبة من القيمة المتوقعة.
لاختبار العمود، فصلنا 50 fmol من هضم جربي من بروتين السيتوكروم C في الانحدار 15 دقيقة من 2-50٪ B. كانت القمم الكروماتوغرافية متناظرة للغاية مع الحد الأدنى من المخلفات. متوسط FWHM كان حوالي ثلاث ثوان.
البروتوكول الموصوف قادر على إنتاج أعمدة UHPLC في حزمة شريط 100 مشتركة تم إعدادها في وقت معقول. يمكن تعبئة أعمدة HPLC أو UPLC القصيرة في غضون دقائق، بينما يتم تعبئة أعمدة طويلة طولها 30-50 سنتيمترا في أقل من ساعة واحدة. الأسلوب فعال لتعبئة المواد الماصة مع RP وأي كيمياء أخرى في أي معرفات العمود.
الأعمدة المنتجة هي فعالة بشكل مستنسخ مثل أي عمود تجاري آخر من نفس الحجم والمعلمات الماصة.
