تسمح هذه الطريقة بالتصور في الوقت الحقيقي للأحداث المختلفة ، التي تحدث في نخاع العظم لفأر الجمجمة ، مثل الخلايا الضخمة ، وتمديد الصفائح الدموية داخل الأوعية الجيبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي جراحة بسيطة تحتاج إلى تقليل رد الفعل الالتهابي ، مما يسمح بتصور في الجسم الحي للأحداث في ظروف المصنع تقريبا. للبدء، نقل الماوس إلى غرفة التصوير.
قم بتشغيل المجهر والكمبيوتر وإعداد المعلمات المطلوبة. مرة واحدة وقد تم تخدير الماوس تماما مكان الماوس على لوحة ساخنة، وتدفأ إلى 37 درجة مئوية للجميع التلاعب التالية، حلق الرأس والحلق من الماوس وتطبيق هلام للعيون لمنع الجفاف. ضع الماوس على ظهره وأصلح الساقين الأماميتين بشريط جراحي لتمديد الحلق.
بعد تطهير الحلق، قم بإجراء شق من 0.7 إلى 1 سنتيمتر على الوريد الوداجي الأيمن أو الأيسر باستخدام مقص ومد النسيج الضام المجاور لفضح الوريد الخارجي المشعوذ فوق العضلة الصدرية. ملء القسطرة مع الحارة، والملوحة الفسيولوجية العقيمة. اختراق القسطرة من خلال العضلات الصدرية ومن ثم إدراج القسطرة في الوريد.
قم بإزالة الإبرة برفق، وربط الحقنة مع التتبعات الفلورية وحقن الحجم الميت للقسطرة. ضع قطرة من الغراء الجراحي لتثبيت القسطرة. أعد الماوس بعناية إلى موضع عرضة.
تطهير فروة الرأس مع 70٪ الإيثانول مع منشفة ورقية أثناء إزالة الشعر فضفاضة. استخدم مقصا وملاقط دقيقة معقمة لإجراء شق على شكل حرف T عند خط الوسط يصل إلى سنتيمتر واحد بين الأذنين على فروة الرأس لكشف الجلجلة. فضح الجمجمة مع ملاقط، ثم استخدام مقص وملاقط لإزالة البيريوستوم بعناية.
استخدام مسحة القطن المعقمة غارقة والمحلول الملحي الفسيولوجية لإزالة جميع periosteum وأي حطام أو الشعر التي يمكن أن تغير التصوير. شطف الجمجمة مع المالحة لإزالة أي آثار الدم وتجفيف العظام بسرعة مع مسحة القطن. تطبيق هلام الغراء على الحلبة، ووضع الخاتم على العظام المكشوفة والحفاظ عليه لبضع ثوان للسماح للحلقة نعلق بحزم على الجمجمة.
ترطيب طفيفة الجمجمة مع مسحة القطن المتشبثة المالحة. إعداد عجينة الأسنان السيليكون عن طريق خلط بعناية المكونات الزرقاء والصفراء بنسبة واحد إلى واحد. ختم الحلبة عن طريق تطبيق معجون الأسنان لمنع التسرب أثناء التصوير.
إزالة بعناية أي عجينة الأسنان أو الغراء التي قد دخلت الحلبة. ثم ملء الحلبة مع المالحة للتحقق من التسرب. ضع الماوس على الدعم ووضع ضغط مطوي تحت رأس الحيوان لرفع الرأس ومنع انفصال الحلقة عن الجمجمة عند إرفاقها بالحامل.
المسمار الخاتم على حامل كتلة. ضع الدعم وتجميع الماوس في غرفة المجهر الساخنة. تعيين أطوال موجية الليزر المناسبة لأربع أربع مختارة واستعادة الأضواء المنبعثة.
باستخدام القسطرة بين المشعوذ حقن 50 ميكرولتر من محلول 0.2 ميكرومولار من التتبع الفلورسنت لتسمية الأوعية الدموية. وضع مرحلة المجهر مع الدعم والفأر تحت الهدف من المجهر. تأكد من أن الحلقة مليئة دائما بالمحلول الملحي وإعادة تعبئته إذا لزم الأمر ، وغمر الهدف والمالحة.
استخدام epifluorescence لتحديد موقع الأوعية نخاع العظم ومراقبة الخلايا الضخمة الانحياز على طول الأوعية الجيوب الأنفية. لعمليات الاستحواذ الطويلة، قم بإعداد اكتساب 3D للزمكان مع صورة 384 في 384 بكسل باستخدام ماسح الرنين 8 كيلو هيرتز، ووضع ثنائي الاتجاه. استخدام خط المتوسط مع دقة جيدة، ثم اختيار حجم الخطوة Z الأمثل وإعداد الفاصل الزمني اللازم قبل بدء الاستحواذ.
بالنسبة لعمليات الاستحواذ القصيرة والسريعة، اختر مساحة ونوع اكتساب الوقت وتقليل حجم الصورة. إذا لزم الأمر، قم بضبط الصورة على السفينة عن طريق تدوير حقل التصوير. استخدم أعلى سرعة مسح متاحة ومسح ثنائي الاتجاه.
تقليل متوسط الخط للعثور على الحل الوسط الأمثل بين تعريف الصورة وسرعة الاستحواذ. احصل على خطة Z واحدة فقط وتصغير الفترة الزمنية للاستحواذ. لقياس سرعة الصفائح الدموية 10 إلى 20 ثانية من اكتساب ينبغي أن تكون كافية.
تم إعطاء التتبع الفلوري عن طريق الوريد لتصوير الأوعية الأنفية النخاعية في نخاع عظم الجمجمة ، مع اتجاه التدفق الذي يصوره السهم. وسجلت سرعة الصفائح الدموية الفلورية في كل فرع من فروع السفن، ولوحظ تباين. الأوعية الجيوب الأنفية الحالية تدفقات معقدة بسبب anastomoses، مع وجود تدفق إعادة تدفق وحتى الركود.
أشارت الأسهم إلى الاتجاه المعاكس للتدفق عند التشعب. كما تم قياس سرعة الصفائح الدموية لفروع السفن اليسرى واليمينية التي أشارت إلى وجود خلل بمرور الوقت في كل فرع من فروع السفن مع مراحل التسارع والركود والتباطؤ. لوحظت مورفولوجيا مختلفة من الألواح، بما في ذلك الألواح ذات الهوامش غير المنتظمة، ثم الألواح البروبليتية التي يتوقون لها والألواح السميكة والقصيرة.
عندما قامت الخلايا الضخمة بتوسيع الصفائح في مناطق التدفقات المعقدة ، تم الزبربلات من فرع سفينة إلى أخرى ، وفقا لاتجاه التدفق. عند وقف تدفق الدم ، خففت الصفائح الدموية وخضع الفأر بشكل غير متوقع لسكتة قلبية ، مما يشير إلى أهمية القوى الهيدروديناميكية في استطالة الصفائح. كما تم قياس عرض وطول الألواح العريضة متوسط عرض 5.2 ميكرومتر، ولوحظ طول أقصى متوسط يبلغ حوالي 185 ميكرومتر.
رسم طول البربليتليت كدالة للوقت يسمح تصور سلوك الصفائح خلال مراحل الاستطالة، ركود، أو حتى التراجع. ولوحظ أن متوسط سرعة الاستطالة يبلغ حوالي 10 ميكرومترات في الدقيقة. تركيب القسطرة، سمح حقن المخدرات لدراسة الآثار على تشكيل البروبليت أو غيرها من الأحداث ذات الأهمية في الوقت الحقيقي.
