جزيئات الإشارات الصغيرة تستهدف البروتينات المختلفة للسيطرة على الفوعة البكتيرية والبيولوجيا البشرية. ومع ذلك، فإن هذه البروتينات التأثيرية صعبة التحديد. كأداة بيولوجيا النظم، DRaCALA يسمح تحديد ممكن وسريع وحساسة للغاية من البروتينات التأثير غير معروف باستخدام مكتبة OVium.
يمكن استخدام DRaCALA لدراسة أي جزيء إشارات صغير طالما يمكن تسميته إما بالنظائر المشعة أو الأصباغ الفلورية. ابدأ بتطعيم الإشريكية القولونية إلى 1.5 ملليلتر من LB المكملة ب 25 ميكروغرام لكل ملليلتر كلورامفينيكول في كل بئر من لوحات الآبار العميقة 96 جيدا لاحتضانها بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية و 160 دورانا في الدقيقة. في صباح اليوم التالي، علاج الثقافات بين عشية وضحاها مع 500 IPTG ميكرومولار لمدة ست ساعات في 30 درجة مئوية للحث على التعبير عن البروتين.
في نهاية الحضانة ، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وإزالة supernatant ، وتجميد العينات في ناقص 80 درجة مئوية. لبدء التحلل ، وإعادة إنفاق الكريات في 150 ميكرولتر من العازلة تحلل واحد لكل بئر لاحتضان لمدة 30 دقيقة في ناقص 80 درجة مئوية قبل إذابة الخلايا لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. ثم يجب تخزين الليسات عند ناقص 80 درجة مئوية قبل الاستخدام.
لإكمال تحلل الخلايا مع البروتينات المفرطة، resuspend العينات في 40 ملليلتر من الجليد الباردة تحلل العازلة اثنين و sonicate العينات في 60٪ السعة في ثانيتين على أربع ثوان قبالة لمدة ثماني دقائق، ثم مسح التحلل عن طريق الطرد المركزي. وبينما يجري طرد العينات، أضف 500 ميكرولتر من راتنج النيكل-NTA المتجانس إلى عمود كروماتوغرافيا البولي بروبلين الدائم. بعد 15 دقيقة، اغسل الراتنج المستقر مرتين مع 15 ملليلتر من الماء فائق البور ومرة واحدة مع 15 ملليلتر من العازلة تحلل اثنين.
في نهاية الطرد المركزي، قم بتحميل الناسخة الغليزة التي تم مسحها على العمود. عندما تتدفق كل اللحواف عبر العمود، اغسل العمود ب 30 ملليلتر من المخزن المؤقت للغسيل. لeute البروتينات، إضافة 400 حجم ميكرولتر من العازلة elution إلى العمود وتكرار elution ثلاث مرات.
آخر 300 حجم ميكرولتر من العازلة elution لتكرار elution ثلاث مرات والجمع بين البروتينات eluted في حجم نهائي من 700 ميكرولتر. لترشيح هلام العينة eluted، بعد غسل عمود استبعاد حجم مع 25 ملليلتر من العازلة الترشيح هلام أعدت حديثا، تحميل كامل حجم البروتين eluted على العمود باستخدام حلقة ميكرولتر 500. تشغيل في 500 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة وجمع 2-3 500 كسور حجم ميكروليتر من البروتينات المعنية.
ثم استخدم أعمدة الدوران الفردية لتركيز كل بروتين واستخدام مجموعة اختبارات برادفورد لقياس تركيزات البروتين وفقا للبروتوكولات القياسية. لتجميع الفوسفور 32 المسمى جوانوسين pentaphosphate، وتجميع رد فعل Relseq على نطاق صغير في أنبوب المسمار توج كما هو موضح في الجدول واحتضان رد الفعل في ThermoMixer لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية وخمس دقائق في 95 درجة مئوية، تليها خمس دقائق على الجليد. في نهاية الحضانات، تدور أسفل البروتين عجلت عن طريق الطرد المركزي ونقل الفوسفور توليفها 32 المسمى جوانوسين pentaphosphate تحتوي على supernatant إلى أنبوب المسمار توج جديدة.
لتخليق الفوسفور 32 غوانوزين رباعي الفوسفات، إضافة واحدة ميكرومولار GppA إلى نصف الفوسفور 32 المسمى جوانوسين pentaphosphate المنتج في أنبوب المسمار توج جديدة واحتضان رد الفعل لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية، وخمس دقائق في 95 درجة مئوية، وخمس دقائق على الجليد. في نهاية الحضانة، تدور أسفل عجل عن طريق الطرد المركزي ونقل الفوسفور 32 المسمى جوانوسين tetraphosphate تحتوي على supernatant إلى أنبوب جديد. لتحليل البروتينات المستهدفة المعزولة، قم بتشغيل ميكرولتر واحد من كل عينة على طبقة رقيقة من لوحة الكروماتوغرافيا باستخدام فوسفات أحادي الوعاء المولي 1.5 كمرحلة متنقلة.
بعد التحليل، ضع اللوحة المجففة في مجلد بلاستيكي شفاف وعرض اللوحة على شاشة الفوسفور التخزيني لمدة خمس دقائق قبل تصور وقياس البيانات على صور الفوسفور. لفحص DRaCALA من البروتينات المستهدفة، إضافة 20 ميكرولتر من الليسات بالجملة المذابة إلى الآبار الفردية من لوحة ميكروتيتر V-bottom 95 جيدا وإضافة 2.5 وحدة من Serratia marcescens endonuclease إلى كل بئر. بعد 15 دقيقة في 37 درجة مئوية، ضع الليسات على الجليد لمدة 20 دقيقة.
بعد ذلك، مزيج كميات متساوية من الفوسفور 32 المسمى جوانوسين pentaphosphate وguanosine tetraphosphate وإضافة 1X تحلل العازلة واحدة إلى الخليط للحصول على محلول خماسي فوسفات جوانوسين نانومولار أربعة. باستخدام ماصة متعددة القنوات ونصائح ماصة المصفاة، مزيج 10 ميكرولتر من خليط الفوسفات الخماسي جوانوسين مع lysate الخلية لاحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، اغسل أداة دبوس 96X ثلاث مرات في محلول 0.01٪ من المنظفات غير الأيونية لمدة 30 ثانية، تليها 30 ثانية من التجفيف على منشفة ورقية لكل غسل قبل وضع أداة الدبوس في لوحة العينة ذات 96 بئرا.
بعد 30 ثانية، ارفع أداة الدبوس مباشرة وضعها مباشرة على غشاء نيتروسيلولوس لمدة 30 ثانية. بعد خمس دقائق من التجفيف، ضع غشاء النيتروسليلوز في مجلد بلاستيكي شفاف لتعرض شاشة الفوسفور التخزيني والتصور عن طريق التصوير الفوسفوري كما هو موضح. لتحديد وتحديد البروتينات المستهدفة المحتملة، في برنامج التحليل المرتبط بصور الفوسفور، افتح ملف الجل للوحات المرئية.
لتعريف المواقع التي سيتم تحليلها، استخدم دالة تحليل الصفيف لإعداد عمود 12 بواسطة شبكة صف ثمانية. لتحديد الحافة الخارجية لنقاط الثقب، حدد الدوائر الكبيرة، واصدر وحدة التخزين بالإضافة إلى الخلفية والمنطقة من الدوائر الكبيرة المحددة إلى جدول بيانات. لتحديد النقاط الداخلية الصغيرة، قم بالحجم أسفل الدوائر المحددة، واصدر وحدة التخزين بالإضافة إلى الخلفية والمنطقة من الدوائر الصغيرة المحددة وحفظ جميع البيانات في جدول البيانات.
دوائر الموقف إلى التداخل مع البقع حسب الضرورة، تغيير حجم أكبر قليلا من البقع الفعلية. استخدم المعادلة لحساب الكسور الربط في جدول البيانات ورسم البيانات. ثم تحديد البروتينات ملزمة المحتملة في الآبار التي تظهر كسور ملزمة عالية بالمقارنة مع غالبية الآبار الأخرى.
في هذا التحليل التمثيلي، يمكن ملاحظة لوحة ذات إشارات ربط خلفية منخفضة نسبيا في معظم الآبار. أظهرت إشارة الربط الإيجابية في بئر H3 كسرا ملزما أعلى بكثير من ذلك الذي لوحظ للأبار الأخرى بسبب الإفراط في التعبير عن بروتين جوانوسين الخماسي الفوسفات الملزم Hpt. وفي اللوحات التمثيلية، أظهرت عدة آبار إشارات ربط خلفية أعلى نسبيا كما تشير إلى ذلك النقاط الداخلية القوية نسبيا التي لوحظت في العديد من الآبار، فضلا عن الكسور الملزمة العالية باستمرار التي لوحظت بعد القياس الكمي.
وتجدر الإشارة إلى أن بعض الأهداف أعطت أيضا كسورا ملزمة متغيرة، مثل الإيجابيات الزائفة. ولتوضيح المزيد، استخدم الباحثون البروتينات النقية لاختبار الربط مرة أخرى. بمجرد تحديد البروتينات المستهدفة ، يمكن للمرء تنقيتها إلى التجانس وتأكيد قوة التفاعل وخصوصية باستخدام إما DRaCALA ، قياس السعرات الحرارية المعايرة ، أو طرق أخرى.
إن تحديد البروتينات المستهدفة لجزيئات الإشارات الصغيرة يمهد الطريق لفهم متعمق للأدوار الناشئة من الفوعة البكتيرية إلى البيولوجيا البشرية.
