وقد يكون هذا البروتوكول بمثابة منصة جديدة لدراسة وتطوير شركات نقل الأدوية لاستهداف مواقع الأمراض داخل نظام الأوعية الدموية البشري. الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أنها تسمح بدراسة تراكم ناقلات الأدوية داخل نموذج الشريان ثلاثي الأبعاد الذي يكرره الإنسان. ويتم ذلك في ظل ظروف فسيولوجية، بما في ذلك تدفق الدم.
يمكن استخدام هذا النهج لتحسين حاملي الأدوية لتشخيص وعلاج مجموعة واسعة من أمراض الأوعية الدموية ، بما في ذلك الشرايين تصلب الشرايين. ابدأ باختيار الصور من المرضى أو هندسات الشريان السباتي البشري التي تمت دراستها مسبقا واستخدام الصور لإنشاء نموذج تصميم بمساعدة الكمبيوتر للقالب. استخدم طابعة ثلاثية الأبعاد لطباعة التصميم، وإزالة دعامات الطباعة المؤقتة وشطف الطراز بالأسيتون قبل استخدام الصنفرة لتلميع القوالب وتنعيمها، وخاصة المناطق التي تم قطع الدعامات منها.
بعد الرملي، شطف النموذج مع الكحول isopropyl لإزالة أي غبار من البلاستيك والسماح للنموذج لتجف في غطاء محرك السيارة الكيميائية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. لتسهيل خيبة أمل سهلة من البلاستيك، رش النموذج مع ورنيش شفاف ثلاث مرات، مما يسمح للورنيش لتجف الهواء لمدة ساعة واحدة بين التطبيقات. بعد التطبيق الأخير، استخدم فرشاة طلاء وورنيش للصق شرائط شفافة ومستطيلة من البلاستيك الناعم على كل جانب من الإطار، بحيث يتم إغلاق النموذج في الجزء السفلي وفتحه في الأعلى.
بعد التجفيف، ضع القالب في مجفف والفقراء ببطء محلول المطاط السيليكون الطازجة المعدة في الافتتاح. إزالة فقاعات الهواء حتى الخليط واضح وترك القالب داخل المجفف بين عشية وضحاها. عندما يكون الخليط جافا تماما، قم بإزالة الشرائح الشفافة وغمر النموذج في الأسيتون المطلق لمدة 48 ساعة في غطاء محرك السيارة الكيميائي حتى يذوب البلاستيك بالكامل.
لتبخر الأسيتون المحاصر قبل بذر الخلايا، واحتضان النموذج لمدة أربعة أيام على الأقل في 60 درجة مئوية. لبذور النموذج مع الخلايا، أولا تعقيم النموذج واثنين من مدخل ومنفذ الموصلات عن طريق الأشعة فوق البنفسجية أو الإشعاع. بعد 20 دقيقة، وذلك باستخدام حقنة لمعطف النموذج مع أربعة ملليلتر من 100 ميكروغرام لكل فيبروكتين ملليلتر لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، قم بإزالة محلول فيبروكتين من خلال المنفذ واغسل النموذج مع متوسط الخلية البطانية. استخدام حقنة لملء نموذج شطف مع أربعة ملليلتر من 2.5 مرات 10 إلى الخلايا البطانية السادسة لكل ملليلتر من تعليق الخلية المتوسطة البطانية وتأمين النموذج إلى الدوار داخل حاضنة ثقافة الخلية 48 ساعة في ثورة واحدة في الدقيقة الواحدة، لضمان التوزيع المتجانس للخلايا. في نهاية الحضانة، استخدم حقنة بلاستيكية 10 ملليلتر لغسل النموذج مع برنامج تلفزيوني.
إصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة، مع أربعة ملليلتر من 4٪ paraformaldehyde، ثم غسل النموذج ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح قبل تخزين النموذج في أربع درجات مئوية في أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد. قبل البدء في تجربة، استخدم أنابيب منفذ لربط المثبط التذبذب متصلة مضخة التجبير إلى مدخل نموذج السباتي المثقف واستخدام قطعة من أنابيب لدمج منفذين. ثم تقسيم أنابيب منفذ لاثنين من أنابيب منفذ وإضافة المشبك البلاستيك إلى كل أنبوب.
لإعداد تكوين الدائرة المغلقة، إضافة 300 ملليلتر من برنامج تلفزيوني إلى حاوية دائرة مغلقة ووضع مدخل واحد وأنبوب منفذ واحد داخل حاوية PBS مليئة المشابك B و C مفتوحة، على التوالي، ثم وضع أنبوب مدخل آخر في وعاء غسيل لتر واحد مليئة بالماء المقطر، وأنبوب منفذ آخر في حاوية نفايات فارغة لتر واحد مع المشابك A و D مغلقة، على التوالي. ضع النموذج السباتي تحت مجهر ستيريو ، وحدد المضخة بمعدل تدفق يبدأ من 10 ثورات في الدقيقة ، مع خمس زيادات في الثورة في الدقيقة كل أربع إلى خمس دقائق. عندما يصل معدل التدفق إلى 100 ثورة في الدقيقة ، أضف 1.6 ميكروغرام من جزيئات البوليسترين الفلورية الكاربوكسيلات لكل ملليلتر من PBS إلى حاوية الدائرة المغلقة وصور المنطقة ذات الاهتمام كل 10 ثوان لمدة ساعة ونصف.
لإعداد تكوين دائرة مفتوحة، افتح المشابك A و D واغلق المشابك B وC على الفور. دع معظم المياه تتدفق من حاوية الغسيل إلى حاوية النفايات بمعدل 100 ثورة في الدقيقة. قبل أن يتم نقل المياه تماما، ووقف المضخة وإغلاق المشابك أنبوب قبل مدخل وبعد منفذ النموذج السباتي.
باستخدام المرشحات المناسبة، التقط صورا للنموذج في المنطقة ذات الأهمية لإظهار ترسب الجسيمات والتصاقها بالخلايا. عند الانتهاء من التجربة، استخدم رمز برنامج مخصص لتحليل الصور الملتقطة في المنطقة ذات الاهتمام، وإدخال اسم الصورة وتعيين العتبة المقدرة. ثم قم بتشغيل التعليمات البرمجية.
فحص الصورة الناتجة وعدد الجسيمات التي تم عدها في الصورة. في هذا التحليل التمثيلي ، يمكن ملاحظة الصور المجهرية للخلايا البطانية المستزرعة المصنفة في نموذج الشريان السباتي ثلاثي الأبعاد من خلال التصوير المجهري confocal المشرق والمضان. عرضت حبات الزجاج الفلورية قطرها 10 ميكرون ، المصنفة في النموذج ثلاثي الأبعاد نمط إعادة تدوير ، مما يشير إلى محاكاة ناجحة للظروف الفسيولوجية داخل النموذج.
وكشف تصوير ترسب الجسيمات أن مستوى أعلى من التصاق الجسيمات بالخلايا لوحظ خارج منطقة إعادة التدوير حيث كان إجهاد قص الجدار مرتفعا. بعد هذا البروتوكول، يمكن استكشاف الجسيمات الوظيفية ذات الحركية الملزمة المحددة والثقافة الأساسية للخلايا داخل نماذج الشرايين البشرية المختلفة لتحسين النموذج ودراسة تركيبات محددة. توفر هذه التقنية منصة جديدة لدراسة استهداف الأوعية الدموية لحاملات الأدوية.
وقد استخدمناه مؤخرا لإظهار كيف يمكن تصميم إضافة الجسيمات لاستهداف مناطق الأوعية المختلفة المريضة.
