يصف هذا البروتوكول تجميع وتشغيل نظام acoustofluidic الذي يمكنه تقديم الجزيئات الحيوية بكفاءة لمجموعة متنوعة من التطبيقات العلاجية القائمة على الأبحاث والخلايا. الميزة الرئيسية لهذا النظام هو أنه يسمح التسليم السريع للجزيئات الحيوية إلى الخلايا مع الحفاظ على قدرتها على البقاء. وهي تقنية منصة تسمح بتحويل الخلايا لمجموعة متنوعة من التطبيقات العلاجية الخلوية، مثل علاج السرطان.
تبدأ من خلال الجمع بين 54 غراما من قاعدة PDMS وستة غرامات من عامل علاج في كوب. تخلط بقوة ودقة مع ملعقة لمدة دقيقة واحدة على الأقل، ثم وضع الكأس مع حل PDMS في مجفف لمدة 30 دقيقة تقريبا أو حتى تتم إزالة بقايا فقاعات الهواء. ضع رقاقة مغلفة بمرسى ضوئي مع الأنماط التي تواجه التصاعدي في طبق بيتري 150 ملليمتر ، ثم صب محلول PDMS على القالب.
إذا لزم الأمر، ضع طبق بيتري داخل مجفف وتطبيق فراغ حتى تختفي فقاعات الهواء المتبقية. نقل طبق بيتري إلى فرن المختبر وخبز لمدة ساعتين في 60 درجة مئوية لعلاج PDMS. بعد المعالجة، قم بإزالة PDMS بعناية من طبق بيتري عن طريق القطع حول حواف الرقاقة بشفرة حلاقة.
قطع كل جهاز على حدة باستخدام سكين أو شفرة حلاقة، ثم ثقب ثقوب من خلال مدخل ومنافذ باستخدام لكمة خزعة 2.5 ملليمتر. بعد علاج جهاز PDMS ببلازما الأكسجين ، ضع كل جهاز على الفور على شريحة مجهر زجاجي نظيف من الجير الصودا مع قنوات تواجه السطح الزجاجي. السماح للأجهزة السندات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
ضعي السيليكون برفق على سطح محول بيزو قطره سنتيمتر واحد بسماكة من 1 إلى 2 ملليمتر، ثم قم بمحاذاة المحول بعناية مع دوامة متحدة المركز واضغط عليه برفق على الجزء السفلي من شريحة المجهر الزجاجي. قم بتوصيل وحدة تحكم دقيقة بجهاز كمبيوتر باستخدام كبل USB A إلى B. وينبغي أن تضيء مؤشرات LED الطاقة الخضراء.
استخدم البرنامج المقترن على الكمبيوتر لتحميل برنامج يقوم بإنشاء إشارة ثمانية ميغاهيرتز. لحام واحد بوصة 22 قياس الأسلاك إلى نهاية كل سلك على محول PZT. ثم استخدامه لتوصيل السلك الطرفي السلبي من محول PZT إلى دبوس GND.
قم بتوصيل سلك المحطة الطرفية الإيجابي لمحول PZT إلى دبوس الإخراج عبر السلك اللحام. قطع ثلاثة إلى ستة أقسام بوصة من أنابيب البلاستيك الناعمة التيجون PVC ودفع الأنابيب في مدخل ومنافذ. قد يكون من الضروري تدوير الأنابيب مع ممارسة الضغط حتى تناسبها في الفتحة.
اختياريا، يمكن تطبيق الغراء عند تقاطع السندات PDMS والأنابيب معا. اختياريا، قم بتركيب الجهاز المتناوب والمتحكم الدقيق في علبة مطبوعة ثلاثية الأبعاد. تجميع خزان microfluidic وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
قطع مقطع من ثلاثة إلى ستة بوصة من 1/16 بوصة القطر الداخلي تايغون PVC أنابيب بلاستيكية لينة ودفعه على أنابيب قطرها الداخلي 1/32 بوصة من إخراج خزان microfluidic. اختياريا، التفاف تقاطع مع فيلم البارافين لمنع التسرب. املأ حقنة 60 ملليلتر بالهواء المحيط على جانب الخزان الدقيق.
تعيين مضخة حقنة بمعدل 200 ملليلتر في الساعة لدفع حلول عامل التباين من خلال الجهاز acoustofluidic بمعدل تدفق الحجمي من 50 ملليلتر في الساعة وجمع العينات من إخراج الجهاز في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر. إعداد محلول phopholipid في قارورة التلألؤ 20 ملليلتر بإضافة 25 ملليغرام من DSPC، 11.6 ملليغرام من DSEPC، 0.26 ملليغرام من DSPG، و 0.88 ملليغرام من البوليوكسي إيثيلين 40 stearate. إضافة الكلوروفورم حتى يتم حل جميع فوسفوليبيدات.
تبخر الكلوروفورم في مجفف لمدة 48 ساعة لتشكيل فيلم الدهون الجافة. إعادة ترطيب الرغوة مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم، ثم سونيكاتي محلول الدهون لمدة ثلاث دقائق في 40٪ السعة لتشكيل محلول micellar cationic. بعد سونيكيشن، يمكن تخزين محلول phopholipid في درجتين إلى ست درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
لإعداد عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية، إضافة 200 ميكرولتر من محلول micellar cationic في 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم إلى قارورة حاجز زجاجي ملليلتر اثنين. ختم القارورة عن طريق تجعيد الغطاء. استخدام إبرة قياس 1.5 بوصة 20 لملء الفضاء رأس قارورة مع غاز ديكافلوروبوتان لمدة 30 ثانية.
دمج القارورة لتشكيل عوامل التباين الموجات فوق الصوتية المليئة بالغاز perfluorobutane. إضافة 25 ميكرولتر من الموجات فوق الصوتية حل عامل التباين لكل ملليلتر واحد من محلول الخلية. ثم ضخ فورا عامل التباين المشترك وخليط الخلية من خلال الجهاز acoustofluidic.
ينتج هذا البروتوكول نظاما acoustofluidic التي يمكن استخدامها لتعزيز التسليم الجزيئي داخل الخلايا في خطوط الخلايا المتعددة. تم تحسين التسليم داخل الخلايا لمركب فلوري ، الفلورسين ، إلى الخلايا التائية البشرية الأولية مع العلاج acoustofluidic مقارنة بمجموعة مراقبة غير معالجة. زادت كثافة الفلورية للخلايا التائية بمقدار خمسة أضعاف بعد العلاج ، مما يشير إلى تعزيز تسليم الفلورسين.
انخفضت صلاحية الخلية قليلا بعد علاج acoustofluidic ، ولكنها ظلت أعلى من 80٪ العلاج Acoustofluidic تعزيز التسليم داخل الخلايا من تريهالوز مركب حافظة لخلايا سرطان الرئة A549 الإنسان مقارنة بالتدفق وحده والخلايا في مجموعة التحكم غير المعالجة. إضافة الفقاعات الدقيقة cationic إلى حل الخلية أمر بالغ الأهمية. وسوف يكون التسليم داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية محدودة دون الفقاعات الدقيقة cationic في الحل.
هذه المنصة تمكن التسليم داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية المختلفة، والتي يمكن أن تغير وظيفة الخلوية لأغراض البحث أو العلاجية. بعد الانتهاء من هذا الإجراء، يمكن إجراء توصيف خلوي إضافي لتقييم تأثير تسليم الجزيئات الحيوية المختلفة.
