يوفر هذا البروتوكول إعدادات تجريبية لأداء ثقافات مشتركة 2D و 3D يمكن التحكم فيها في الأجهزة الدقيقة لتصور ومراقبة المحادثات المتقاطعة للخلايا المناعية للورم وتحليل آثار العلاجات المضادة للسرطان. توفر هذه التقنية تصورا سهلا وفي الوقت الفعلي لتجنيد الخلايا المناعية وتفاعلاتها ويمكن استخدامها للعينات البشرية والمستمدة من المريض. وهو متوافق مع معظم المجاهر الحديثة.
وسيقوم بتوضيح الإجراء فرانشيسكو نوتو ، طالب دكتوراه في قسم الأورام والطب الجزيئي ، المعهد العالي للصحة ، ونيكوليتا ماندوكا وإستير ماكافيو ، طلاب الدكتوراه في جامعة كاتوليكا ديل ساكرو كور ، قسم الطب الانتقالي والجراحة. يتم تنشيط الرقائق مسبقا بالبلازما في منظف البلازما أو آلة حفر الحديد التفاعلية في غرفة نظيفة. يتم استخدام خلايا الطحال وخط الخلايا السرطانية هنا لمحاكاة البروتوكولات الموضحة في النص.
قبل تحميل تعليق الخلايا ، اسحب الوسائط من جميع الخزانات الستة. ثم قم بتحميل 1 × 10 ببطء إلى الخلايا السرطانية الخامسة المعاد تعليقها في 10 إلى 50 ميكرولتر من وسط النمو في الخزان الأيسر العلوي والبئر السفلي. على الجانب الأيمن ، ماصة بلطف 1 × 10 إلى الخلايا المناعية العائمة السادسة المعاد تعليقها في 50 ميكرولتر من وسط النمو في بئرين.
عند إضافة جميع الخلايا ، املأ جميع الخزانات الستة لكل شريحة بما يصل إلى 100 إلى 150 ميكرولتر من وسط النمو وتحقق من توزيع الخلايا بشكل صحيح داخل كل حجرة استزراع. احتضان الشريحة لمدة ساعة واحدة للسماح للنظام بالاستقرار قبل تسجيل الفاصل الزمني. لتصوير الخلايا الحية ، قم بتركيب الورم المناعي على لوحة الرقاقة على مرحلة المجهر.
قم بتخصيص إعداد سير عمل الاستحواذ في واجهة برنامج المجهر مثل برنامج تحليل الخلايا الحية Incucyte. حدد نوافذ المراقبة ومعدل الإطارات الأمثل والمدة الزمنية ، اعتمادا على المعلمات المناسبة للتجربة وأنواع الخلايا قيد الدراسة. صور الخلايا للفترة الزمنية التجريبية المناسبة.
قم بإعداد حصتين من matrigel المخففة بوسط يحتوي على دواء أو مزيج من الأدوية للحالتين التجريبيتين باستخدام نصائح باردة. الخلايا السرطانية الماصة المتوافقة بلطف مع الصبغة الحية والمصبوغة بالفلورسنت معلقة في محلول مصفوفة على الجليد للحصول على توزيع متجانس للخلايا. باستخدام لوحة الرقاقة على كتلة تبريد أو على سلة بها ثلج ، قم بحقن محلول مصفوفة الخلايا السرطانية المعالج بالأدوية ببطء في منافذ الهلام اليمنى واليسرى باستخدام أطراف ماصة صغيرة باردة سعة 10 ميكرولتر.
اضغط برفق لدفع محلول المصفوفة من جانب واحد من القناة إلى الجانب الآخر. عندما يتم تحميل جميع الخلايا السرطانية ، ضع الجهاز في الحاضنة في وضع رأسي لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، بمجرد اكتمال هلام المصفوفة ، املأ القنوات المتوسطة لجميع الخزانات الستة ب 50 ميكرولتر من وسط الاستزراع.
تحقق من سلامة الجل المبلمر وتوزيع الخلايا السرطانية تحت المجهر. ثم ضع الرقائق في حاضنة حتى يكتمل تحضير الخلايا المناعية. بعد الحضانة ، استنشاق الوسيط من كل بئر.
ضع الطرف بالقرب من مدخل القناة المتوسطة الوسطى واستخدم ضغطا معتدلا لحقن 10 ميكرولترات من 10 برفق إلى الخلايا المناعية السادسة الموسومة بصبغة فلورية متباينة. حقن 50 إلى 100 ميكرولتر من الوسط في كل من الآبار الأربعة للقنوات الجانبية ، و 40 إلى 90 ميكرولترا من الوسط في البئر المركزي العلوي ، و 50 إلى 100 ميكرولتر من الوسط في البئر المركزي السفلي. عندما يتم تحميل جميع الآبار ، استخدم المجهر للتأكد من أن توزيع الخلايا المناعية ظل محصورا في الغرفة المركزية.
ثم ضع الجهاز بعناية على سطح مستو في حاضنة زراعة الخلايا حتى التصوير. لحساب مدى تسلل الخلايا المناعية الحية الملطخة بالفلورسنت إلى حجرات الورم ، قم بتصوير الجهاز في نقاط زمنية محددة ذات أهمية بواسطة الفحص المجهري الفلوري واضبط معلمات الكاميرا المناسبة في برنامج التصوير المجهري ، مثل Nikon NIS-Elements. قم أيضا بتعيين المعلمات للخلايا المناعية المسمى.
يمكن تتبع حركة الكريات البيض من خلال جسور microchannel المبنية بشكل مناسب في منصة الموائع الدقيقة نحو الخلايا المستهدفة عن طريق الفحص المجهري بالفيديو. في تحليل التتبع هذا ، تم تحدي PBMCs الفردية مع موت خلايا سرطانية معالجة بدوكسوروبيسين أو خلايا سرطانية حية معالجة ب PBS. تم إنشاء قيم الانجذاب الكيميائي ذات الصلة ومخططات الهجرة تلقائيا ، ولوحظ ملف تعريف هجرة مختلف للخلايا المناعية عند تحميلها المشترك مع خلايا سرطان الثدي المعرضة لدوكسوروبيسين أو برنامج تلفزيوني.
عندما واجهت PBMCs خلايا سرطان موت الخلايا المبرمج ، عبروا القنوات الدقيقة نحو الخلايا المحتضرة والميتة لكنهم لم يعبروا إلى الخلايا الحية غير المعالجة. أظهر جزء صغير من كريات الدم البيضاء ذات الكثافة المتزايدة على مدار 24 إلى 48 ساعة اتصالات طويلة الأمد مع الخلايا السرطانية المعالجة بدوكسو. في هذا التحليل ، تم استخدام نموذج ورم جديد 3D مناعي لتحديد تجنيد الخلايا المناعية استجابة لمجموعات مضادة للسرطان من الأدوية اللاجينية.
ثم تم توزيع PBMCs ذات العلامات الحمراء بشكل متجانس في غرفة السوائل المركزية. ثم تمت مقارنة قدرة كتلتي الورم على جذب PBMCs ، مع تجنيد PBMCs بقوة في هذه التجربة في القناة الدقيقة اليمنى. بالنسبة لنموذج 3D ، امزج المحلول مع هيدروجيل وخلايا على الجليد ، وتجنب الفقاعات والبلمرة المسبقة.
حقنه ببطء دون ضغط مفرط. ضبط خطوات البلمرة وفقا للمصفوفة المستخدمة. يمكن تنفيذ فحوصات الخلايا الحية / الميتة وتوصيف إفراز السيتوكين من المواد الطافية.
يمكن إجراء التألق المناعي للتصوير متحد البؤر لتصنيف الأنواع الفرعية المناعية ولعلامات التعبير عن النضج والاستنفاد.
