وسرعان ما أصبحت النهج البروتيومية المستهدفة الطريقة المفضلة للتحقق من صحة البروتينات من التجارب القصيرة الأجل القائمة على البروتيوميات أو من التجارب القائمة على البيولوجيا الجزيئية. ورصد التفاعل المتعدد هو أحد هذه النهج المستهدف الذي يستخدم على نحو متزايد للكشف عن البروتينات المستمدة من العينات البيولوجية وتحديدها كميا. في هذه الدراسة مشينا من خلال مختلف الخطوات المشاركة في الكشف عن وقياس البروتينات من أنسجة الدماغ البشرية بهدف تعريف القراء على المتطلبات الأساسية لتجربة MRM.
تزن حوالي 50 ملغ من أنسجة الدماغ، وغسل الأنسجة مع 300 ميكرولتر من المالحة 1x الفوسفات المخزنة. يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة أي دم على السطح الخارجي للأنسجة ، وبالتالي فمن المستحسن إزالة أكبر قدر ممكن من الدم. بعد يغسل مع برنامج تلفزيوني، إضافة 300 ميكرولتر من العازلة تحلل إلى أنبوب يحتوي على الأنسجة.
Lyse الأنسجة باستخدام سونيكاتور التحقيق مع الحفاظ على أنبوب على حمام الجليد. الاستمرار في تجانس الأنسجة باستخدام الخافض حبة لتحلل تماما الأنسجة. الطرد المركزي محتويات الأنبوب في 6000 غرام لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.
نقل supernatant في أنبوب جديد وتخلط بشكل متجانس. خذ a aliquot صغيرة من supernatant، وقياس محتوى البروتين باستخدام المقايسة البروتين القياسية. هنا نعرض مثالا على تقدير البروتين باستخدام برادفورد اساي.
خذ 50 ميكروغرام من البروتين في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتقليل المحتويات عن طريق إضافة TCEP بحيث يكون التركيز النهائي 20 ملليمولار. احتضان المحتويات في 37 درجة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، يقلل من البروتينات المخفضة عن طريق إضافة iodoacetamide إلى الأنبوب ، بحيث يكون التركيز النهائي 40 ملليمولار.
احتضان الأنبوب في الظلام لمدة 30 دقيقة. الآن إضافة العازلة B إلى الأنبوب تحتوي على البروتينات المنخفضة و alkylated بحيث التركيز النهائي لليوريا هو أقل من واحد الأضراس. إضافة التريبسين في 1 كما إلى 30 نسبة الإنزيم إلى البروتين واحتضان الأنابيب بين عشية وضحاها في 37 درجة مع اهتزاز مستمر.
بعد الهضم، ركز الببتيدات المهضومة في مركز فراغ. في هذه الخطوة، يمكن إعادة تشكيل الببتيدات وإزالة تحلها أو تخزينها عند ناقص 80 للاستخدام في المستقبل. يعد تحلية المياه، أو تنظيف الببتيد، أمرا ضروريا قبل تحميل العينات على أي مرض التصلب المتعدد LC-MS. يمكن أن تسد الأملاح والملوثات الأخرى في العينة العمود وتؤثر على حساسية الجهاز على المدى الطويل.
يمكن تنفيذ هذه العملية باستخدام تلميحات أو أعمدة C18 STAGE المتاحة تجاريا. هنا قمنا بتصوير سير العمل لتحلية الببتيد باستخدام تلميح C18 STAGE. بعد تحلية، وتجفيف الببتيدات في تركيز فراغ.
إعادة تشكيل هذه الببتيدات النظيفة والمضي قدما في القياس الكمي باستخدام طريقة النطاقات. لهذا، قم بتحميل اثنين ميكرولتر من العينة في لوحة ميكرودرروب وحساب التركيز كما هو مبين في الشريحة. إعداد قائمة الانتقال خطوة حاسمة في تجربة SRM أو MRM.
تحتوي قائمة الانتقال على جميع المعلومات المطلوبة من مطياف الكتلة لمراقبة الانتقال. ويشمل ذلك قيم m by z لأيونات السلائف والمنتجات، وطاقة التصادم في المرحلة الانتقالية، وقطبية الأداة، والنطاق الزمني للحصول على البيانات. قم بإعداد قائمة الانتقال باستخدام Skyline.
إعداد بروتيوم الخلفية باستخدام ملف فاستا البروتيوم الإنسان من UniProt وتأكد من أنه يتم تحديده تحت علامة التبويب الخلفية من إعدادات الببتيد. في علامة التبويب تصفية، حدد الحد الأدنى للطول 8 والحد الأقصى للطول 25. استمر في استخدام الإعدادات الافتراضية إذا لم تكن هناك تعديلات أخرى في الببتيدات.
بمجرد إجراء إعدادات الببتيد ، انقر على إعدادات الانتقال. ضمن علامة التبويب تصفية تعيين رسوم السلائف كما 2 و 3. تعيين رسوم الأيونات ك 1 وتعيين أنواع الأيونات إلى y.
يمكن تحديد أيونات المنتجات حسب اختيار المستخدم. اترك كافة المعلمات كإعدادات افتراضية. الآن إدراج معرفات الانضمام من البروتينات المستهدفة المختارة.
ويمكن القيام بذلك عن طريق النقر على تحرير علامة التبويب ثم اختيار إدراج ولصق أخيرا معرفات الانضمام. سيتم تعيين معرفات إلى البروتينات في البروتيوم الخلفية وقائمة الانتقال التي تم إنشاؤها استنادا إلى إعدادات الببتيد والانتقال التي تم تعيينها في وقت سابق. تصدير قائمة الانتقال هذه.
تأكد من اختيار الأداة المناسبة بالنقر فوق الخيار المنسدل لنوع الأداة. في هذه الحالة، فإن الأداة هي ثيرمو ألتيس. نظرا لأن قائمة الانتقالات غير المعرفة تحتوي على عدد كبير جدا من الانتقالات، احتفظ بحد أقصى قدره 350 انتقالا فقط لكل قائمة وتصدير كطرق متعددة.
يتم استخدام نظام المذيبات الثنائية. المذيبات A هي 1٪ FA والمذيب B هو 80٪ ACN. حافظ على معدل التدفق عند 450 ميكرولتر في الدقيقة والتدرج كما هو موضح.
تعيين درجة حرارة حجرة العمود في 45 درجة مئوية. لمزيد من التفاصيل حول العمود ونظام LC، راجع النص. تأكد من أن إعدادات التصلب المتعدد في TSQ Altis كما هو موضح هنا.
استيراد قائمة انتقال واحدة لإنشاء أسلوب جديد. نقترح أن تبقي القرار لquadrupole 1 وquadrupole 3 في 7. ويمكن تحسين هذه الخطوات إذا لزم الأمر.
لضمان التناسق في التشغيل وبالتالي جودة البيانات، قم بإعداد تسلسل التشغيل كما هو موضح. تبدأ مع اثنين من الفراغات، راجع النص لتكوين خليط فارغ، تليها ضوء معيار مراقبة الجودة BSA من التركيز المعروف لرصد أي اختلاف في استجابة اليوم الحكيم للصك. يجب أن يكون مراقبة الجودة القيام به قبل العينات.
السطر التالي حتى جميع العينات مع الفراغات في ما بين. حقن كميات متساوية من كل عينة، وهو ما يمثل 25 إلى 1 نانوغرام من الببتيدات لكل حقنة. لجعل أسلوب المكرر تشغيل أولا أساليب غير معرفة مقابل عينات كاملة.
استيراد النتائج إلى Skyline والتحقق يدويا من كل الببتيد. لكل الببتيد، حدد واحد السلائف تظهر قمم جيدة باستمرار في جميع العينات. حذف السلائف والببتيدات التي لا تظهر قمم جيدة.
تأكد من أن جميع القمم مشروحة بشكل صحيح. لتحديد الذروة الصحيحة وزيادة صقل التحولات تحت كل مقدمة ، يمكن استخدام مكتبة. المكتبة هي مجموعة من البيانات الطيفية MS-MS المتطابقة مع الببتيدات والتحولات للبيانات التجريبية الحالية.
اختر القمم التي تحتوي على قيم DART P أقرب إلى 1 وقم بإزالة الانتقالات التي لا تتطابق مع المكتبة. تشير قيمة DART P إلى مدى أهمية المباراة بين الذروة التجريبية وذروة المكتبة. بعد جولة أو جولتين من التحسين، ستكون القائمة المكررة جاهزة.
يمكن تشغيل هذه القائمة المكررة لعينات فردية. استيراد أشواط المكرر في الأفق وقمم التعليقات التوضيحية بشكل صحيح. استخدم علامة التبويب التعليق التوضيحي ضمن إعدادات المستند لإضافة تعليق توضيحي على كل عينة في شبكة المستند بعناية.
استخدم ميزة مقارنة المجموعة لإنشاء مقارنات بين الشرط 1 والشرط 2 من تجربتك. وهذا سيعطي الجدول مع قيم P المعدلة وقيم التغيير أضعاف بين المجموعتين. على حد علمنا، هذه هي الدراسة الأولى التي تستخدم استخدام MRM للكشف عن الببتيدات للبروتينات Apolipoprotein A-1، فيمنتين، ونيكوتيناميد فوسفوريبوسيل ترانسفيراز في عينات أنسجة الدماغ البشرية.
يمكن أن يؤثر تحسين المعلمات المختلفة مثل تدرج LC ووقت الإسهاب ووقت الدورة وطاقة الاصطدام بشكل كبير على نجاح تجربة MRM. ونحن نعتقد أن هذه التقنية يمكن استخدامها لتطوير أنماط من المؤشرات الحيوية مع القدرة على التمييز بين الظروف السريرية المختلفة والأمراض.
