البروتوكول أظهرت هنا يمكن أن تساعد على توضيح التركيب الحيوي من البولي فوسفاتات إينوزيتول من النباتات والإجابة على الأسئلة المتعلقة بدورها في جوانب معينة من التمثيل الغذائي النباتي والتنمية. هذه الطريقة هي حساسة للغاية لأن استخدام السلائف المسمى إشعاعا من الفوسفات إينوزيتول يسمح للكشف الموثوق بها لجميع أنواع الفوسفات إينوزيتول في النباتات. إن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة مهم لأن معظم علماء الأحياء النباتيين غير معتادين على تحليل HPLC والإعداد المطلوب.
بالإضافة إلى ذلك، من الصعب اتباع الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول، مثل استخراج الفوسفات الإينوزيتول، دون مظاهرة مناسبة. تبدأ من خلال إعداد نظام يتكون من اثنين من مضخات HPLC مستقلة، واحدة للمخزن A واحد لمضخات B.Both العازلة تحتاج إلى التحكم معا عن طريق جهاز كمبيوتر أو مضخة رئيسية. تنفيذ غسل الختم المكبس لكلا المضخات، إما عن طريق قوة الجاذبية أو من خلال مضخة الضغط المنخفض الثالثة.
توصيل كل من مضخات إلى خلاط ديناميكي, ثم توصيل الخلاط لصمام حقن مع حلقة عينة التي لديها على الأقل قدرة ملليلتر واحد. استخدم الشعيرات الدموية لتوصيل صمام الحقن بالعمود والعمود إلى جامع الكسور. زرع بذور اللوتس في صف واحد على أطباق بيتري مربع مليئة وسائل الإعلام نموا الصلبة التي تتكون من 0.8٪ الأجار البكتريولوجية في المياه الأيونية.
السماح للبذور إلى تقسيم لمدة ثلاثة أيام على الأقل في أربع درجات مئوية في الظلام. ضع البذور في حاضنة النمو. نقل 10 إلى 20 شتلة في بئر واحد من 12-جيدا واضحة لوحة ثقافة الخلية السفلي مسطحة مليئة مليلترين من محلول ملح التصلب المتعدد نصف القوة التي تستكمل مع 1٪ السكروز وتعديلها إلى درجة حُمر 5.7.
إضافة 45 ميكروكوري من 3H ميو-إينوزيتول إلى لوحة ودوامة بلطف. غطي الطبق بغطاء وختمه بشريط جراحي صغير. ثم ضعه مرة أخرى في حاضنة النمو.
بعد خمسة أيام من وضع العلامات، وإزالة الشتلات من وسائل الإعلام وغسلها لفترة وجيزة مع المياه ديوند. جففها بمناشف ورقية ونقلها إلى أنبوب ميكروسنتروفوج 1.5 ملليلتر، مع التأكد من عدم الإفراط في ملء الأنبوب. المفاجئة تجميد الأنبوب في النيتروجين السائل وتخزينه في ناقص 80 درجة مئوية حتى الاستخراج.
خذ العينات من الفريزر والاحتفاظ بها في النيتروجين السائل حتى تصبح جاهزة للاستخدام. طحن لهم مع أنبوب microcentrifuge آفة حتى تبدأ في الذوبان، ثم إضافة 500 ميكرولترات من الجليد الباردة استخراج العازلة. مواصلة طحن حتى يتم تجانس العينة والحل هو الملونة.
أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقائق في 18،000 مرة G وأربع درجات مئوية. ثم نقل المناط إلى أنبوب 1.5 ملليلتر الطازجة. وتعتبر الأنابيب المستخدمة في الاستخراج نفايات مشعة صلبة وتحتاج إلى التخلص منها وفقا لذلك.
إضافة بعناية 300 ميكرولتررس من تحييد العازلة إلى استخراج، والتي سوف تسبب على الفور هطول الأمطار من البروتينات ومحتدما. بعد دقيقة واحدة، اخلطي العينة مع طرف ماص وماصات خمسة ميكروليت على ورق pH للتأكد من أن نسبة الـ PH تتراوح بين سبعة وثمانية. إذا لزم الأمر، إضافة كميات صغيرة من إما تحييد العازلة أو استخراج العازلة حتى يتم الوصول إلى درجة حُكم الاستخلاص المطلوب والسماح للعينات بقية على الجليد لمدة ساعة واحدة على الأقل مع غطاء مفتوح.
ثم الطرد المركزي لهم لمدة 10 دقائق ونقل المابير في أنبوب 1.5 ملليلتر الطازجة. تجهيز جامع الكسور مع 96 قنينة صغيرة من التألق وملء كل قارورة مع ملليلترين من كوكتيل التلألؤ مناسبة متوافق مع مخازن درجة ح OH منخفضة وتركيزات عالية من فوسفات الأمونيوم. بدء تشغيل نظام HPLC، ثم تفعيل غسل الختم المكبس والحفاظ على تنشيطه خلال المدى كله.
حقن العينة يدويا مع حقنة مناسبة. بدء تشغيل المضخات والتدرج. أثناء تشغيل HPLC مستمر، تحقق من الضغط بانتظام.
ضغط البداية يجب أن يكون حوالي 18 إلى 24 بار وينبغي أن ترتفع ببطء إلى 50 إلى 60 شريط مرة واحدة يتم التوصل إلى 100٪ المخزن المؤقت B. بعد المدى، وإغلاق قوارير بإحكام وهز بقوة الكسور مع كوكتيل التلألؤ لخلط. إذا لم يكن المضي مباشرة مع القياس، والحفاظ على قارورة في وضع مستقيم في الظلام.
لقياس الكسور، أدخل القنينات في رفوف مضادة التلألؤ باستخدام رفوف تناسب القنينات الصغيرة وتقيس كل قارورة لمدة خمس دقائق في عداد التلألؤ السائل. قم بإعداد مخطط خطي 2D حيث يتم رسم عدد القياسات في الدقيقة أو CPM مقابل وقت الاحتفاظ. لمقارنة العينات مع بعضها البعض، تطبيع البيانات عن طريق تلخيص CPM من كل كسر مائل من الدقيقة 25 إلى 96 لكل عينة الفردية وعن طريق تقسيم إجمالي CPM من تلك العينة على إجمالي CPM من العينات الأخرى.
لتنفيذ القياسات النسبية لبعض قمم البولي فوسفات إينوزيتول، ثم إنشاء الرسوم البيانية شريط التي تحتوي على بيانات من النسخ المتماثل للتحليلات الإحصائية، مواصلة التحليل مع البرامج المتخصصة التي يمكن حساب مناطق الذروة من الكروماتوجرامات. يتم عرض كامل من قبل الإينوزيتول متعدد الفوسفات التي تم الحصول عليها من مقتطفات A.thaliana بعد العد التلألؤ هنا. يتم فصل القمم بشكل جيد ويمكن تعيينها إلى الأيزومرات المختلفة.
عندما يتم استخدام عمود العمر, انخفاض واضح من hexakisphosphate إينوزيتول وعدم وجود بيروفوسفات إينوزيتول مرئيا. كما تم إجراء تحليل SAX-HPLC على شتلات L.japonica التي نمت ووصفت في ظل نفس الظروف مثل شتلات Arabidopsis. في حين يفترض أن جميع أنواع البولي فوسفات إينوزيتول والقمم التي تعرف من Arabidopsis يمكن أن ينظر إليه, هناك اختلافات في الكميات النسبية من ايزومرات إينوزيتول متعددة الفوسفات محددة بين النوعين.
ولإثبات أن العينات لا يتعين تحليلها مباشرة بعد الاستخراج، تم تقسيم عينة واحدة إلى اثنين ونصفها تم تحليلها في اليوم التالي بعد التخزين عند ناقص 80 درجة مئوية. ولم تكن الاختلافات بين مواصفات SAX-HPLC للعينات الطازجة والمجمدة كبيرة، مما يدل على أن دورة التجميد-ذوبان الجليد الواحدة لا تضر بالعينة وأن الطريقة نفسها تولد نتائج قابلة للاستنساخ. عند محاولة هذا البروتوكول, طحن دائما العينات بدقة, المجمدة ومع العازلة استخراج, وتهدف إلى قريبة من درجة PH محايدة بعد تحييد لضمان أقصى قدر من الانتعاش من الفوسفات إينوزيتول المسمى الراديو لتحليل SAX-HPLC.
فمن الممكن لتنقية radio-labeled من تشغيل SAX-HPLC لاستخدامها في وقت لاحق، على سبيل المثال في ردود الفعل المتبادلة عن طريق جمع الكسور دون كوكتيلات التلألؤ وقياس aliquots الصغيرة فقط.
