يسمح لنا هذا البروتوكول بالقدرة على عزل الخلايا التائية الليمفاوية عن المرضى الذين يعانون من المرض للدراسات والعيب الجزيئي والعيب المناعي. تسمح لنا هذه الطريقة بعزل الخلايا القابلة للحياة ، والخلايا التي بها تشوهات مرضية لتنقية الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين من هؤلاء المرضى والتي تسمح لنا بتوصيف العيوب الجزيئية لفهم تشوهات المسارات المهمة في الإمراض. هذه الطريقة ذات قيمة لعزل الدم المحيطي الذي يمكن تقسيمه بشكل أكبر لدراسة خلايا الدم في الحالات الطبيعية ، وكذلك خلايا الدم من الأمراض التي تعاني من تشوهات مناعية.
ستوضح هذه العملية ألانا ، وهي زميلة أبحاث لطلاب الطب من مختبري. بعد الحصول على عينة دم محيطية في خمسة أنابيب سعة 10 ملليلتر تحتوي على مضادات التخثر ، قم بنقل 10 إلى 15 ملليلتر من الدم إلى أنابيب فصل 50 ملليلتر تحمل رقم الموضوع وتخفيف العينات مرتين على الأقل ، ولكن إلى ما لا يزيد عن 35 ملليلتر لكل أنبوب مع HBSS. قم بتكديس الدم بعناية وببطء مع ما يقرب من 13 ملليلتر من متوسط الكثافة لكل أنبوب ، ووقف السحب عندما تكون الماصة فارغة تقريبا لمنع الفقاعات.
قم بإزالة الماصة ببطء لتجنب خلط طبقات الدم والكثافة المتوسطة ونقل أنابيب الفصل المملوءة بعناية إلى جهاز الطرد المركزي دون إزعاج الطبقات. بعد فصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، قم بإزالة جميع البلازما التي تحتوي على الطبقة العليا باستثناء آخر 10 ملليلتر ، قبل جمع المعطف الرقيق بعناية وببطء. قم بتجميع المعطف الرقيق من بين أنبوبين منفصلين في أنبوب واحد معقم سعة 50 ملليلتر وقم بتخفيف PBMC مرتين على الأقل مع HBSS الطازج إلى ما مجموعه 50 ملليلتر لكل أنبوب.
عندما يتم جمع جميع المعاطف الباهتة ، قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإزالة أكبر قدر ممكن من السوبرناتانت من كل أنبوب. اضغط على قاع الأنبوب لتخفيف الكريات وإعادة تعليق الكريات في واحد إلى ملليلترين من المخزن المؤقت لتحلل ACK لكل حجم عينة دم أصلي يبلغ 10 ملليلتر لكل أنبوب. بعد خمس دقائق بالضبط ، أوقف التحلل في كل أنبوب بحجم مساو أو أكبر من HBSS واضبط كل حجم على 50 ملليلتر.
بعد الطرد المركزي ، تخلص من السوبرنات ، وقم بتجميع الخلايا من نفس المتبرع ورفع حجم يصل إلى 50 ملليلتر مع HBSS طازج لجهاز طرد مركزي آخر. ثم أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية RP 10F المتوسطة للعد. لتنقية الخلايا التائية CD4+CD45RO+T-cell، قم بتدوير الخلايا وتخفيف PBMC إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر من تركيز المخزن المؤقت للاختيار.
انقل الخلايا إلى أنبوب بوليسترين مستدير القاع بسعة خمسة ملليلترات وأضف 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لكل ملليلتر واحد من العينة مع خلط لطيف. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، دوامة الجسيمات المغناطيسية بسرعة عالية لمدة 30 ثانية قبل إضافة 50 ميكرولتر من الجسيمات المغناطيسية لكل ملليلتر واحد من العينة إلى الأنبوب مع خلط لطيف. ارفع مستوى الصوت إلى 2.5 ملليلتر مع مخزن مؤقت للاختيار الطازج وخلط لطيف ووضع الأنبوب على مغناطيس لمدة 2.5 دقيقة.
في نهاية الحضانة ، التقط المغناطيس وقلب الأنبوب في حركة واحدة مستمرة لصب تعليق الخلية المخصب في أنبوب معقم جديد. لزيادة استعادة الخلية ، أضف 2.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للاختيار إلى الأنبوب دون إزعاج الخرز المثبت لحضانة أخرى لمدة 2.5 دقيقة على المغناطيس وأضف الغسيل إلى أنبوب التجميع ، ثم عد عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم وتأكد من نقاء الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. لتنشيط الخلايا ، اضبط خلايا CD4 + CD45RO + T على خمس مرات 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من 37 درجة مئوية RP 10F متوسط التركيز وزرع الخلايا في أطباق استزراع ذات حجم مناسب.
ضع الخلايا في حاضنة رطبة تبلغ 37 درجة مئوية ، 5٪ من ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، قم بجمع الخلايا المريحة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات بمعدل خمس مرات 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من 37 درجة مئوية RP 10F تركيز متوسط. قسم التعليق إلى خمسة إلى 10 مرات 10 إلى الأليكوتات الخلية السادسة في كل من ثلاثة أنابيب غطاء لولبي معقم وتحفيز الخلايا في الأنبوب الثاني مع PMA والأنبوب الثالث مع A23187 والخلط اللطيف.
أضف كمية متساوية من ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى الأنبوب الأول ليكون بمثابة التحكم في السيارة ووضع الأنابيب مع تخفيف الأغطية في الحاضنة لفترة التنشيط المناسبة. في نهاية الحضانة ، قم بجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتخلص من أكبر قدر ممكن من supernatant دون إزعاج بيليه الخلية. ثم قم بتحليل الخلايا وفقا لتوجيهات مجموعة عزل الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا وعزل الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
إن صلاحية ونقاء خلايا CD4 + CD45RO + T التي تم الحصول عليها بواسطة بروتوكول الاختيار السلبي هذا عالية باستمرار. عادة ما يكون عائد خلايا CD4 + CD45RO + T التي تم الحصول عليها من غرف نظام تقليل الكريات البيض من SS PBMCs حوالي 75٪ مقارنة بحوالي 16٪ من PBMCs المانحة الطبيعية.
بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعبير عن العديد من الجينات التي لا يتم التعبير عنها عادة في الخلايا التائية المانحة الطبيعية بشكل كبير في الخلايا التائية SS سواء أثناء الراحة أو بعد التحفيز. تقنية معقمة جيدة وروتين ثابت مهمان حقا لنجاح هذه التقنية. من المهم أيضا أثناء وضع طبقات Ficoll أن تستخدم ماصة أوتوماتيكية مع تحكم دقيق وأن تنتبه حقا إلى السرعة التي تضع بها Ficoll.
ستكون الخلايا المعزولة باستخدام هذه الطريقة قابلة للحياة ويمكن استخدامها في دراسات السمية والدراسات الكيميائية الحيوية الجزيئية لتوصيف مسارات نقل الإشارة وقياس التدفق الخلوي ودراسات التعبير الجيني. يمكن استخدام هذه الطريقة لعزل الخلايا عن المرضى الذين يعانون من المرض ، والأمراض الالتهابية ، وكذلك الأمراض الأخرى مثل السرطانات للدراسات المباشرة. وتشمل الأمثلة على هذه الأمراض الصدفية والتهاب الجلد التأتبي.
