يمكن أن تحفز معلمات التحميل الميكانيكية المختلفة خلايا STEM المشتقة من الأوتار التي تم تمييزها في خلايا مختلفة. نحن نقدم عملية مفصلة لتطبيق هذا ثلاثي الأبعاد التحفيز الميكانيكية ثلاثية الأبعاد نظام مفاعلات الحيوية للحث على التمايز tenogenic من الخلايا الجذعية المشتقة من الأوتار. اعتلال التدين هو واحد من الإصابات الرياضية الشائعة في قسم العظام.
وجود اعتلال وتر أخيل هو الأكثر شيوعا مع ما يصل إلى 29٪ للعدائين المسافات المتوسطة والطويلة، في حين أن وجود tendinopathy الرضفة أيضا عالية في الرياضيين من الكرة الطائرة وكرة السلة والمضمار والميدان وكرة اليد وكرة القدم. ومع ذلك، نظرا لقدرة الشفاء الذاتي محدودة من وتر وعدم وجود علاج فعال، اعتلال الأوتار لا يزال له تأثير سلبي كبير على نوعية حياة المرضى. الخلايا الجذعية المشتقة من الأوتار، والمعروفة باسم TDSCs كالخلايا السليفة الهامة لخلايا الأوتار، تلعب دورًا مهمًا في تطوير اعتلال الأوتار، وكذلك استعادةها الوظيفية والهيكلية بعد اعتلال الأوتار.
ولكن تختلف عن معلمات التحميل الميكانيكية، مثل تحميل الإجهاد، وتواتر التحميل، ونوع التحميل، وفترة التحميل يمكن أن تحفز TDSCs التفريق في خلايا مختلفة. وهكذا، نظام تحميل ميكانيكي فعال وصالح مهم جدا لنشأة وتر. هناك سبع مراحل من البروتوكول الحالي، بما في ذلك عزل TDSCs الفئران، والثقافة والتوسع في TDSCs الفئران، وإعداد ثقافة التحفيز المتوسطة لتشكيل ورقة الخلية، وتشكيل ورقة الخلية عن طريق زراعة في التحفيز المتوسط، وإعداد 3D وتر الخلايا الجذعية بناء، وتجميع الخلايا أحادية الإرax التي تمتد مجمع التحفيز الميكانيكية، وتقييم الميكانيكية حفز في الأنسجة مثل وتر في المختبر.
عزل الفئران TDSCs. المستخدمة في الفئران التي هي الفئران التي عمرها ستة إلى ثمانية أسابيع من قبل خلع عنق الرحم. حصاد وتر الرضفة وأوتار أخيل.
هضم وتر مع ستة ملليلتر نوع 1 collagenase لمدة ثلاث ساعات. جمع الخلايا والثقافة في كامل ألفا MEM تحتوي على 10٪ من FBS و 1٪ من المزيج الستريبتوميسين والنسلين لمدة سبعة أيام. تحديد TDSCs باستخدام فرز الخلايا المُنشّط بالفلور بواسطة عملية استئصال الخلايا المتدفقة، والتعبير عن علامات سطح الخلية، بما في ذلك CD4 و CD90 و Sca-1.
عدم التعبير عن CD34 و CD45. مرور وتجميد الخلايا. سيتم استخدام الخلايا الممرّة لخطوات أخرى.
الثقافة والتوسع في TDSCs الفئران. تأخذ الاحماء الفئران وتر الخلايا الجذعية. إضافة ببطء إضافية أربعة إلى خمسة ملليلتر من كامل ألفا MEM.
نقل الخليط إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر بواسطة ماصة. أعلى مع متوسطة إلى ما مجموعه ثمانية ملليلتر من قبل ماصة. ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي توازن جيد.
خلايا الطرد المركزي في 347 ز لمدة خمس دقائق. أخرج أنبوب من جهاز الطرد المركزي. تحقق من بيليه في الجزء السفلي.
Decant المتوسطة الحرة. إعادة تعليق الخلايا بلطف في 1-2 ملليلتر متوسطة كاملة. تجنب صنع فقاعات كثيرة جدا.
نقل الخلايا التي أعيد تعليقها إلى قارورة T75 بواسطة ماصة. استخدم ماصة لإضافة واسطة ألفا ميم كاملة إلى القارورة لتصل إلى حجم إجمالي قدره 10 ملليلتر مع التركيز النهائي البالغ 13000 خلية لكل سنتيمتر مربع. ضع القارورة في الحاضنة و ثقتها عند 37 درجة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
تغيير الوسط كل ثلاثة أيام. مراقبة ومراقبة الخلايا تحت المجهر عند تغيير المتوسطة حتى يتم استزراع الخلايا إلى التقاء 100٪. إعداد ثقافة التحفيز المتوسطة لتشكيل ورقة الخلية.
صب 15 ملليلتر إكمال ألفا MEM المتوسطة في أنبوب معقم 15 ملليلتر. إضافة ستة ميكرولتر حمض الاسكوربيك في 15 ملليلتر المتوسطة إلى التركيز النهائي من 4.4 ميكروغرام لكل ملليلتر. مزيج بلطف عن طريق عكس صعودا وهبوطا.
تشكيل ورقة الخلية عن طريق زراعة في التحفيز المتوسطة. تجاهل غير عادي كامل ألفا MEM المتوسطة بعناية. تجنب لمس الخلايا التي تعلق على الجزء السفلي من القارورة.
إضافة 10 ملليلتر التحفيز المتوسطة ببطء. تجنب التسبب في أي اضطراب في الخلايا المُلَكّمَة تمامًا. زراعة الخلايا في التحفيز المتوسط لمدة تسعة أيام وتغيير المتوسطة كل ثلاثة أيام لتوليد ما يكفي ورقة الخلية في 37 درجة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
إعداد 3D وتر STEM خلية بناء. أخرج القارورة من الحاضنة تجاهل وسيط التحفيز تماما.
غسل ورقة الخلية monolayer مع برنامج تلفزيوني عن طريق دوامة القارورة. تجاهل برنامج تلفزيوني تماما. استخدام ماصة لإضافة ملليلتر واحد، 0.25٪ التربسين إلى زاوية القارورة.
انقر فوق زاوية القارورة لفصل ورقة الخلية أحادية الطبقات حتى تغسل زاوية ورقة الخلية من أسفل القارورة. على الفور إضافة تسعة ملليلتر كاملة ألفا MEM المتوسطة لوقف رد فعل التربسينية. مواصلة دوامة قارورة لتقشر تماما قبالة ورقة الخلية monolayer.
صب المجموع لإرفاق ورقة الخلية في طبق بيتري مع المتوسطة. استخدم ملاقطة معقمة لالتقاط زاوية واحدة من ورقة الخلية وتدويرها في اتجاه عقارب الساعة لمدة 15 مرة. التقاط آخر نهاية ورقة الخلية وتدوير في اتجاه عكس عقارب الساعة لمدة 10 مرات لصياغة وتر مثل في المختبر بناء.
تجميع مجمع التحفيز الميكانيكي أحادي التمدد في مفاعل حيوي فريد التصميم. قم بتوصيل الخطافات بواسطة الموصل، ثم اضبط إلى سنتيمترين بين خطافين. الرياح بلطف TDSCs 3D بناء على الخطاف التجريبي لثلاث مرات على كل هوك.
تأمين السنانير مع بناء الخلية على غرفة مفاعل حيوي عن طريق تشديد مسامير على طرفي. ملء الغرفة مع كامل ألفا MEM المتوسطة. قم بتوصيل المسرع بغرفة الثقافة بواسطة الكابل.
قطع hooks'connector بواسطة ملاقط عقيمة. قم بتشغيل وحدة التحكم في الطاقة والقناة لبدء التحفيز الميكانيكي. وضع غطاء على الغرفة، وتتبع أضواء المؤشر، وضمان أن يمكن أن تعمل بشكل صحيح.
وضع مفاعل حيوي في الحاضنة واخضاع بناء الخلية 3D لتمتد الميكانيكية. نظام التحميل هو 6٪ سلالة، 0.25 تردد هيرتز، ثماني ساعات تليها 16 ساعة راحة لمدة ستة أيام. تقييم الميكانيكية حفز في نسيج يشبه وتر في المختبر.
تخفيف مسامير من قبل مفك واتخاذ الجمعية قبالة بعناية. وضع الأنسجة الشبيهة بأوتار في 4٪ PFA لتثبيت لمدة 15 دقيقة، ضع الأنسجة الثابتة الشبيهة بأوتار في كاسيت خزعة مع خزعة من الحيوانات الأليفة. معالجة لتجفيف عينة.
وأخيرا، تقييم من قبل HD مكانة النسيجية. كرر البروتوكول بأكمله واستخراج RNA من الأنسجة الشبيهة بأوتار لتقييم التعبير عن علامات التنغيم بواسطة qPCR. قبل التحفيز الميكانيكي، سوف تنمو TDSCs إلى 100٪ التقاء في المتوسط الكامل وعرض مورفولوجيا هيكلية خارجية غير منظمة.
بعد ستة أيام رأيت المقبل تمتد، والتحميل الميكانيكية، مصفوفة الخلوية اضافية، وكانت موجهة بشكل جيد الانحيازات الخلية. كانت الخلايا مأهولة بشكل جيد ومغلفة بشكل جيد في ECM بعد التحميل الميكانيكي. وقدم مورفولوجيا الخلية ليكون موجودا وكان أكثر شبها لخلايا الأوتار العادية مقارنة مع واحد مع دون تمتد.
كثافة الخلية في بناء الخلية مع تحميل كانت أعلى من واحد دون تحميل. وأظهرت نتائج qPCR أن الأمور الحالية زادت من التعبير عن علامات تينوجيني، بما في ذلك scleraxis، موهوك، تينومودولين، والكولاجين من النوع 1 مقارنة بتلك التي تعامل بها الثقافة المعلنة. من حيث التحفيز الميكانيكية نظام مفاعل حيوي، تم استخدام غرفة منفصلة مع المحرك الخطي في البروتوكول الحالي لدينا.
لأنه يمكن أن توفر دقة التحميل الميكانيكية وأنه محمول وسهلة ليتم تعديلها بالمقارنة مع الطرق التقليدية ورقة الخلايا 2D وتمتد biaxial، 3D بناء الخلية هو أكثر مماثلة لشكل حقيقي من وتر. وتمتد uniaxial هو أكثر مماثلة لخصائص قوة خلايا الأوتار. وهذا يوفر أساسا نظريا لاستخدام نظام 3D تمدد uniaxial لتحفيز التفريق بين TDSCs.
وهكذا، تم توجيه ورقة الخلية 2D أخيرا إلى بناء خلية 3D وخضع uniaxial في هذا البروتوكول. وفقا لنظامنا مفاعلات حيوية، لدينا نظام التحميل هو 6٪ سلالة، 0.25 تردد هيرتز، ثماني ساعات تليها 16 ساعة راحة لمدة ستة أيام. وأخيراً، تجلت فعالية البروتوكول من خلال مورفولوجيا ومستوى التعبير عن العلامات التي تُنوِّه.
عملية التشغيل برمتها بسيطة، ولكن المشغل بحاجة إلى أن تولي اهتماما للحفاظ على بيئة TDSC تعقيم في جميع الأوقات. هناك العديد من التطبيقات لبروتوكولنا. عملية تحفيز TDSCs لتقليد التمايز في الجسم الحي مفيد للتحقيق في العملية المرضية لاعتلال الأوتار.
وعلاوة على ذلك، يوفر هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار للتمايز الموجه من TDSCs في الأنسجة الشبيهة بالأوتار. لذلك يمكن استخدامه ببساطة وفعالية لثقافة الأوتار المهندسة المحتملة. وباختصار، فإن تطبيق نظام 3D أحادي الأبعاد للتحفيز الميكانيكي أحادي الأبعاد للتحفيز الحيوي هو بسيط واقتصادي ويمكن استنساخه وطريقة صالحة للحث على التمايز التفاضلي للـ TDSCs.
بروتوكولنا يوفر العملية برمتها في التفاصيل.
