في هذا البروتوكول، نحن وصف إجراء يحتوي على جزأين. أولا, أحادية الطبقات 2D keratinocyte طريقة التمايز في المختبر عن طريق تثبيط الاتصال. ثانيا ، توصيفها الجزيئي من قبل RNA - seq.
طريقة التمايز 2D في المختبر واضحة وسهلة الأداء. ويمكن استخدامه لدراسة التمايز البشرة، وخصوصا عندما يكون هناك عدد كبير من الخلايا اللازمة. على سبيل المثال، في التحليل الجينومي.
خط أنابيب تحليل RNA-seq مفصلة واضحة وشفافة للباحثين ذوي المهارات الأساسية المعلوماتية الحيوية، ويمكن استخدامه لأي تحليل RNA-seq السائبة. عند تنفيذ بروتوكول التمايز لأول مرة، نضع في اعتبارنا أن كثافة البذر يمكن أن تكون صعبة. جرب كثافة البذر المتعددة لمعرفة أي واحد يعمل بشكل أفضل مع خط الخلية.
تبدأ من خلال إعداد متوسط نمو الكيراتينوسيتي أو KGM و 500 ملليلتر لكل من متوسط الانتشار والتمايز المتوسط وفقا لاتجاهات المخطوطات. بذور keratinocytes الأولية في كثافة من 5 إلى 20، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع وإضافة ما يكفي من وسائل الانتشار لتغطية الخلايا. بعد يومين من البذر، تحديث الخلايا مع وسيلة الانتشار.
تحقق من الخلايا بانتظام تحت المجهر وتحديث المتوسطة كل يوم. عندما تصل الخلايا إلى 90٪ من الالتقاء، تحث على التمايز عن طريق تغيير الوسط إلى وسيط التمايز. لجمع الخلايا لمزيد من التحليلات RNA، وغسل الخلايا مرتين مع DPBS ومن ثم إضافة العازلة تحلل.
جمع الخلايا في أيام التمايز صفر، اثنين، أربعة، وسبعة. بعد عزل الحمض النووي الريبي، سيتم تحويل cDNA المزدوجة التي تقطعت بها السبل وسيتم إعداد مكتبات الحمض النووي الريبي -seq لتسلسل الجيل القادم. بعد التسلسل، سيتم تحميل قراءة تسلسل وتعيين الجينوم البشري.
بعد تحميل وتثبيت حزم R، إنشاء جدول حساب من readspergene.out. ملفات التبويب وكتابة نموذج ملف البيانات التي تحتوي على كافة أسماء الملفات، يوم التمايز وغيرها من البيانات ذات الصلة. راجع ملفات الترميز التكميلية للحصول على مثال.
ثم استخدم جدول العدد و عينات البيانات لإنشاء كائن deseq2 يحتوي على كل من بيانات قابل للعد و عينة. للتطبيع التعبير الجيني، تطبيع جدول العد في deseq2 الكائن باستخدام إما deseq2RLD أو التطبيع VST. بينما يفضل التطبيع RLD، التطبيع VST هو أسرع بكثير.
استخدم دالة dist في R لرسم مسافة العينة استناداً إلى كثافة عدد القراءة التي تم تسويتها، ثم قم بتنفيذ تجميع hclust استناداً إلى مسافة العينة. بعد ذلك، رسم خريطة الحرارة باستخدام وظيفة فياتاب. وأخيراً، قم بإنشاء تحليل مكون أساسي أو مؤامرة PCA من كثافة عدد القراءة تطبيع باستخدام الدالة plotPCA deseq2.
يعمل PCA كأداة في تحليل البيانات الاستكشافية ويمكن استخدامه لتصور المسافة والاتصال بين العينات المختلفة. إجراء تحليل التعبير الجيني متغير للغاية مع وظيفة rowVars التي تستخرج أعلى 500 الجينات متغير للغاية عن طريق ترتيب على التباين بين العينات من نقاط زمنية مختلفة. هذه الجينات لديها أعلى انحراف معياري من كثافتها تطبيع عبر أيام من التمايز.
تنفيذ k-يعني التجمع على الجينات متغيرة للغاية لتجميع لهم أنماط التعبير المختلفة. تصور الجينات في خريطة الحرارة مع حزمة فياتاب. الكثافة المرسومة في خريطة الحرارة هي كثافة deseq2 تطبيع مع القيمة الوسيطة المطروحة.
إنشاء قائمة من الجينات الخلفية أعرب عن ذلك التي تشمل جميع الجينات مع أكثر من 10 العد في عينة واحدة وجعل قائمة مع الجينات من كل مجموعة. وأخيراً، قم بإجراء تحليل علم الولوج الجيني باستخدام GOrilla. استخدام قائمة الجينات الخلفية ومجموعة الخلفية وقائمة الجينات المتغيرة للغاية في مجموعات كما مجموعة الهدف، ثم انقر على البحث المخصب المصطلحات GO.
بدلاً من ذلك، يمكن للمستخدمين R أكثر تقدماً استخدام حزمة مجموعةProfiler لأتمتة تحليل الإثراء المصطلح GO. واستخدمت خطوط الكيراتينوسيت المستمدة من خمسة أفراد للتمايز في تحليلات الحمض النووي الريبي-الصد. أظهر تحليل المكون الرئيسي أن الكيراتينوسيات التي تمر بالتمايز كانت مرتبطة ولكن ملامح التعبير الجيني العام المتميزة.
وتجمّهرت الجينات الشديدة التباين لتصور ديناميات التعبير الجيني وأنماطه أثناء التمايز. كل مجموعة من الجينات ممثلة الجينات الوراثية التمييز keratinocyte السمة المميزة واظهار الجينات Ontology شرح اختلاف واضح في وظائف الجينات. في التجربة الثانية، تمت مقارنة الاختلافات في مورفولوجيا الخلايا والتعبير الجيني بين خلايا الكيراتينوس من الضوابط الصحية وخطوط الخلايا المشتقة من المرضى الذين يحملون طفرات P63.
وأظهر تحليل المكونات الرئيسية أن خطوط الخلايا التحكمية تتبع بوضوح نمطاً من التمايز، ولكن نمط التعبير الجيني للخلايا المتحولة أثناء التمايز يبقى مشابهاً إلى حد كبير لنمط الخلايا المتكاثرة أو غير المتمايزة. في تحليل التجمع، كانت الجينات في المجموعة الأولى من المواد الهابطة في خلايا التحكم ونزلت جزئيا في الخلايا المريضة التي تحمل طفرات R204W وR279H، ولكن ظلت عالية في الخلايا التي تحمل R304W. هذه الجينات من المرجح أن تلعب أدوارا في انتشار الخلايا كما يتضح من تحليل علم التناطولوجيا الجينية.
تم إدخال جينات المجموعة الثانية لأول مرة وبالتالي الضوابط الهانائية في خلايا التحكم. ومن المرجح أن تشارك هذه الجينات في تمايز الكيراتينوسيت كما تم إثراء التمايز الجلد ووظائف الكيراتين للغاية لهذه المجموعة. تم حث الجينات في المجموعة الثالثة فقط في نهاية التمايز في خلايا التحكم مما يشير إلى أنها قد تلعب دورًا في الطبقة الخارجية من البشرة.
عند تحليل بيانات RNA-seq، من المهم أن نعرف مسبقا ما يمكن توقعه. هذا سوف تساعدك على حد سواء مع تفسير مراقبة الجودة ومؤامرة PCA وفي تقييم ما إذا كانت النتائج الخاصة بك هي معنى. يمكن استخدام أساليبنا لدراسة النسخ الجيني سواء في علم الأحياء البشرة وكذلك في النظم البيولوجية الأخرى.
